復(fù)合型灌注式生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與其在構(gòu)建長節(jié)段組織工程骨中的應(yīng)用.pdf

1、創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因造成的四肢大段骨缺損是骨科臨床工作中常見而棘手的問題。當(dāng)骨缺損的范圍超過了機(jī)體修復(fù)能力時(shí)，會(huì)引起肢體短縮、畸形，最終導(dǎo)致肢體功能障礙。為了解決大段骨缺損這一難題，人們嘗試使用異體骨、自體骨移植、骨骼延長術(shù)等多種方法來修復(fù)骨缺損，但因存在機(jī)體排異、傳播疾病、來源有限、產(chǎn)生新的創(chuàng)傷等問題而效果不佳。隨著生物學(xué)和材料學(xué)的發(fā)展，以這兩門學(xué)科為基礎(chǔ)的生物工程技術(shù)為解決這一臨床難題帶來了新的希望。該技術(shù)的關(guān)鍵要素包括：具有成骨

2、活性的功能細(xì)胞，有良好骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性的生物材料；主要技術(shù)路線：將細(xì)胞與生物材料復(fù)合，細(xì)胞能夠在合適的條件下擴(kuò)增、分化、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終構(gòu)成具有活性的組織工程骨。與其他器官的組織工程技術(shù)一樣，在骨組織工程中不僅要模擬適合細(xì)胞生存的體內(nèi)環(huán)境，還要大幅度提高細(xì)胞培養(yǎng)、分化的效率，因此靜態(tài)培養(yǎng)模式遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要，必須借助生物反應(yīng)器來構(gòu)建活性人工骨。雖然目前已有多種面向骨組織工程的生物反應(yīng)器問世，但大多為構(gòu)建體積較小、外形簡單的組織工程

3、骨而設(shè)計(jì)，缺乏適合構(gòu)建體積較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜活性人工骨的生物反應(yīng)器。本實(shí)驗(yàn)以柱狀多孔磷酸三鈣生物陶瓷（β-TCP）和兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）為研究對象，設(shè)計(jì)、制造了一種新的復(fù)合型灌注式生物反應(yīng)器，研究通過改進(jìn)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)來提高體外構(gòu)建大體積活性組織工程骨效率的可行性。
　　一、復(fù)合型灌注式生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與制造
　　目的構(gòu)建一種能在灌注室內(nèi)產(chǎn)生間歇性低壓的復(fù)合型灌注式生物反應(yīng)器，觀察其對長節(jié)段、多孔β-TCP材料的灌注

4、效果。方法組配式生物反應(yīng)器的主要構(gòu)件如Berzelius燒杯、鋁合金板材等材料均為市售，按照設(shè)計(jì)進(jìn)行搭建。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)液在灌注室內(nèi)灌注支架的同時(shí)，自動(dòng)控制的真空泵可以在灌注室內(nèi)產(chǎn)生間歇性低壓。用非永久性食用色素顆粒染色的柱狀β-TCP分別在常壓和間歇性低壓環(huán)境中（-0.01Mpa，0.5Hz）以不同的灌注率進(jìn)行灌洗，比較材料色素顆粒洗脫效果，以研究新的灌注環(huán)境對不同灌注率下材料內(nèi)灌注液行為的影響。結(jié)果常壓環(huán)境中，較高地灌注

5、流量能更充分地洗脫顆粒，但在材料上半部仍有殘留；即使灌注率較低時(shí)，在間歇性低壓環(huán)境中的材料上所染的色素顆粒能更均勻地被洗脫。結(jié)論間歇性低壓環(huán)境可以影響灌注液流在長節(jié)段、柱狀多孔β-TCP材料內(nèi)的行為，使低灌注率下灌注液在材料內(nèi)均勻分布，避免高灌注率對細(xì)胞的剪切力損傷。
　　二、兔BMSCs/材料復(fù)合方法的研究
　　目的尋找一種簡單、高效的BMSCs與空心柱狀β-TCP支架材料的復(fù)合方法，并且適于細(xì)胞/材料復(fù)合體的進(jìn)一步體外灌

6、注培養(yǎng)。方法取10月齡新西蘭大白兔雙側(cè)股骨骨髓，反復(fù)貼壁法純化、培養(yǎng)BMSCs。使用第2代BMSCs制成1×107/ml、5×106/ml和1×106/ml細(xì)胞濃縮液，分別以0.1、0.2和1.0ml的體積緩慢滴注于柱狀β-TCP材料內(nèi)部的管道中，分別記為方法A、B、C，記錄各組操作所耗時(shí)間。靜置兩小時(shí)后收集從材料中滲出的BMSCs并計(jì)數(shù)，計(jì)算各種方法的細(xì)胞/材料復(fù)合率。結(jié)果在三組方法中，方法A、B最為快捷（2.13±0.13min、2

7、.07±0.16min），操作C耗時(shí)較長（4.60±0.21min）；B組的細(xì)胞/材料復(fù)合率最高（64.33±2.20％），高于B、C兩組（54.00±1.67％、54.17±2.90％），以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論基于β-TCP特殊的構(gòu)型，濃縮細(xì)胞懸液滴注法是一種理想的細(xì)胞/材料復(fù)合方法。
　　三、BMSCs/β-TCP復(fù)合體在復(fù)合型灌注式生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)
　　目的在復(fù)合型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)BMSCs/β

8、-TCP復(fù)合體，通過檢測代謝、成骨分化指標(biāo)，觀察該生物反應(yīng)器的培養(yǎng)效果。方法將BMSCs/β-TCP復(fù)合體分別進(jìn)行靜態(tài)、常壓灌注和間歇性低壓灌注培養(yǎng)，記為對照組、實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、實(shí)驗(yàn)組Ⅱ。各組均經(jīng)歷為期1周、2周、3周和4周四個(gè)階段的培養(yǎng)，定時(shí)收集培養(yǎng)液檢測葡萄糖日耗量、堿性磷酸酶比活性、骨橋蛋白水平，在各培養(yǎng)周期的終末行細(xì)胞活力（MTT）和硬組織切片檢查。結(jié)果在培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ的日均葡萄糖消耗量和細(xì)胞活力均高于實(shí)驗(yàn)組Ⅰ和對照組（P<