人臍血單個核細(xì)胞移植對大鼠急性心肌梗死后心功能及左室重構(gòu)的影響.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)后所造成的心肌細(xì)胞壞死和纖維疤痕形成最終將導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的左心室功能減退，這也是造成心肌梗死(MI)病人死亡和生活質(zhì)量下降的主要原因。雖然目前可實施藥物治療及早期介人干預(yù)，但已丟失的心肌不能再生。近年來心肌細(xì)胞重塑為MI治療提供了一個有希望的新方法，以前所用種子細(xì)胞多來源于胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞(造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞及邊緣細(xì)胞)、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及胎心細(xì)胞等，最近國外亦有利用臍血干細(xì)胞做種子細(xì)胞的體內(nèi)或體外試驗的報

2、道。臍血富含造血干細(xì)胞，同時含間充質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞，且取材方便，是理想的種子細(xì)胞來源，本研究將含臍血干細(xì)胞的人臍血單個核細(xì)胞(hUCBC)注射到大鼠MI部位，觀察大鼠心功能改變及左室重構(gòu)情況。 材料和方法:1.hUCBC提取和標(biāo)記：10份臍血均來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，產(chǎn)婦健康。分離方法采用羥乙基淀粉(賀斯)沉淀加ficoll-paque密度梯度離心法。移植前將細(xì)胞置于含10umol/L溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和10

3、％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度和5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時行移植前細(xì)胞標(biāo)記。BrdU是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，BrdU可以摻入新合成的DNA鏈，通過生物素-鏈霉親和素連接的抗體及DAB系統(tǒng)顯色來檢測BrdU，定位己標(biāo)記的移植細(xì)胞。 2.動物模型制作和細(xì)胞移植：Wistar雄性大鼠，體重150-200g，購自中山大學(xué)動物中心。大鼠分為三組，每組各15只，MI對照組和移植組動物均在

4、氣管插管后行開胸手術(shù)，結(jié)扎成功后，將3×107個細(xì)胞/150ul單個核細(xì)胞懸液分三點注射到梗死區(qū)與正常心肌交界處，MI對照組注射等量DMEM。假手術(shù)組僅開胸并在左前降支下過線，不結(jié)扎。 3.心功能檢測：細(xì)胞注射4周后，利用超聲心動圖行心臟檢查。超聲評價后，經(jīng)右側(cè)頸動脈插入左心導(dǎo)管至左心室，與多導(dǎo)生理紀(jì)錄儀相連，記錄血流動力學(xué)參數(shù)。 4.標(biāo)本檢測及膠原密度檢測：細(xì)胞移植后四周，處死動物，取心臟標(biāo)本。沿心臟長軸將心臟從心尖至

5、結(jié)扎點切成五片，每片厚約2mm。4％多聚甲醛固定24小時，石臘包埋，5um厚連續(xù)切片，行HE染色及Masson染色以觀察心肌病理改變，同時利用圖像分析儀對非梗死區(qū)行膠原容積定量分析，以了解MI后心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)情況。 5.標(biāo)記細(xì)胞檢測：為檢測移植細(xì)胞的存活性及去向，移植前細(xì)胞利用BrdU標(biāo)記。動物處死后，取兩只大鼠心臟組織切片，用抗BrdU單克隆抗體行免疫組化染色，存活的移植細(xì)胞BrdU染色陽性。 6.統(tǒng)計學(xué)分析：測量結(jié)

6、果用-x±s表示，組間比較采用方差分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)處理采用SAS軟件進(jìn)行。 結(jié)果:1.一般情況：在冠狀動脈結(jié)扎復(fù)制AMI模型的手術(shù)中，動物沒有死亡。結(jié)扎后數(shù)分鐘，即可觀察到冠狀動脈左前降支供血區(qū)域顏色發(fā)白。但是，術(shù)后養(yǎng)殖過程中，有少數(shù)動物死亡：移植組死亡1只，MI對照組死亡2只，假手術(shù)組死亡1只。多死于術(shù)后一周內(nèi)，主要是因為手術(shù)創(chuàng)傷、動物抵抗力下降所造成的胸腔感染所致，MI對照組有1只術(shù)后第30天行

7、超聲檢查時，死于急性左心衰竭，表現(xiàn)為呼吸頻率明顯加快，口腔，鼻腔有大量粉紅泡沫痰涌出。 2.動物模型評價：左前降支結(jié)扎四周后，HE染色呈典型梗死的病理改變，左室前壁透壁性梗死，可見梗死區(qū)明顯變薄，并有大量纖維結(jié)締組織形成。 3.干細(xì)胞移植對AMI大鼠血流動力學(xué)的影響見表1。其中LVSP、+dp/dtmax為反映左室收縮功能的指標(biāo)，其值越高說明心臟收縮功能越好；LVEDP及-dp/dtmax為反映左室舒張功能的指標(biāo)，LVE

8、DP的增高及-dp/dtmax的降低表示心臟舒張功能受損。結(jié)果表明：MI對照組及移植組LVSP、±dp/dtmax均較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.01)，而LVEDP較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)，說明心梗后大鼠收縮功能及舒張功能均受損，導(dǎo)致了心功能不全。實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)hUCBC移植后，實驗組LVSP、+dp/dtmax較MI對照組升高(P＜0.05)，說明hUCBC心梗區(qū)移植后可使左心室收縮功能改善，而LVEDP增高幅度較MI對照組下

9、降(P＜0.05)，-dp/dtmax較MI對照組升高(P＜0.05)，則說明hUCBC心梗區(qū)移植后可改善左心室舒張功能。 4.超聲心動圖檢查結(jié)果見表2。其中射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室后壁增厚率為反映左室收縮功能的指標(biāo)，其值越大表明左室收縮功能越好。左室舒張末期內(nèi)徑、左室舒張末期容積、左室后壁厚度、梗死區(qū)室壁厚度、球形指數(shù)(舒張期左室長徑/舒張期左室短徑)為反映左室形態(tài)及結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，左室舒張末期內(nèi)徑及左室舒張末期容積越大，左

10、室后壁厚度、梗死區(qū)室壁厚度及球形指數(shù)越小，提示梗死后左室重構(gòu)程度越嚴(yán)重。通過超聲心動圖檢查，移植組和MI對照組心臟結(jié)構(gòu)與功能各指標(biāo)均較假手術(shù)組明顯惡化，但移植組較MI對照組有改善，表1可見移植組左室收縮功能較MI對照組提高[EF(48.96±8.80)比(37.35±10.2)，P＜0.05]，同時移植組反映左室重構(gòu)程度的左室舒張末期內(nèi)徑亦較MI對照組有明顯縮小[(7.51±0.65)mm比(8.57±1.09)mm，P＜0.05]，梗

11、死區(qū)厚度增加[(6.9±1.10)mm比(5.8±1.03)mm，P＜0.05]。M型超聲下：假手術(shù)組大鼠左室壁運動曲線波動幅度正常，MI對照組左室壁運動曲線明顯變平。移植組左室壁運動曲線較MI對照組明顯改善，保持了較好的心功能，左室內(nèi)徑也較小，梗死區(qū)室壁較厚。 5.免疫組化染色結(jié)果：大鼠心肌Masson染色條件下膠原纖維呈藍(lán)色，胞漿、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色。在MI對照組，非梗死區(qū)心肌間質(zhì)膠原密度較假手術(shù)組顯著增加，心肌細(xì)胞腫脹，

12、排列紊亂。假手術(shù)組心肌細(xì)胞間僅見少量膠原纖維，呈條索狀與心肌纖維平行排列。移植組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞腫脹及排列紊亂現(xiàn)象均較MI對照組改善，心肌細(xì)胞間膠原亦明顯減少。定量分析結(jié)果表明：移植組非梗死區(qū)左室心肌間膠原容積顯著降低，與MI對照組相比差異有顯著性[(6.65±2.54)cvf比(11.05±3.73)cvf，P＜0.01](cvf：膠原容積分?jǐn)?shù))。抗BrdU染色后可見到深褐色，胞核呈BrdU染色陽性的細(xì)胞散在分布于梗死區(qū)，顯示移植的h

13、UCBC可在梗死區(qū)成活。部分染色陽性的細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，參于到血管壁的組成。MI對照組梗死區(qū)及其周邊均未檢測到BrdU陽性的移植細(xì)胞。 結(jié)論:1.本實驗采用的動物模型，符合AMI后左室重構(gòu)和功能障礙的基本病理特征，是研究AMI后左室重構(gòu)的病理機制和治療措施的良好實驗動物模型。 2.臍血干細(xì)胞具有獨特的免疫原性，在不使用免疫抑制劑的情況下在大鼠梗死區(qū)移植，移植的細(xì)胞在宿主體內(nèi)能夠存活。 3.本試驗顯示，臍血干細(xì)胞在