三倍體虹鱒卵巢敗育的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、虹鱒（Onchorynchus mykiss），屬于鮭形目(salmoniformes)，鮭科(salmonidae)，大麻哈魚屬（Oncorhynchus）。該魚是FAO向世界推薦的高品質(zhì)養(yǎng)殖對(duì)象之一，也是我國(guó)最主要的鮭鱒魚引進(jìn)品種和養(yǎng)殖對(duì)象。由于三倍體雌性虹鱒在鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)中顯示了諸多優(yōu)點(diǎn)，如性腺不發(fā)育、肌肉品質(zhì)好等。因此，以全雌三倍體虹鱒作為鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主力品種已成為大勢(shì)所趨。
　　眾所周知，鮭科魚類即便多出一套甚至兩

2、套染色體也能夠生存和繁殖，這是其他脊椎動(dòng)物不具有的特性。四倍體和雄性三倍體虹鱒與二倍體虹鱒性腺具有相同結(jié)構(gòu)與功能，然而，三倍體雌性虹鱒是一個(gè)例外，早期卵巢呈線狀，并且缺少初級(jí)卵母細(xì)胞。因此，三倍體虹鱒的性別分化與發(fā)育機(jī)制之間的本質(zhì)區(qū)別成為了研究焦點(diǎn)。盡管與性別決定和分化的相關(guān)基因在二倍體虹鱒中已被鑒定出來，如sdY、Dmrt1、Cyp19a1a、Foxl2和Sox9等，但關(guān)于三倍體雌性虹鱒獨(dú)特性腺表型及其相關(guān)性別控制基因的表達(dá)規(guī)律仍未得

3、到深入研究，尤其是早期卵巢發(fā)育阻滯導(dǎo)致的生殖細(xì)胞去分化特征。因此，本研究以三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育中起重要調(diào)控作用的特異候選基因作為重點(diǎn)研究對(duì)象，輔助性腺體細(xì)胞與生殖細(xì)胞分化方向的組織學(xué)證據(jù)和類固醇激素表達(dá)規(guī)律，并通過外源性激素誘導(dǎo)，對(duì)三倍體雌性虹鱒的性腺表型發(fā)育進(jìn)行預(yù)期調(diào)控，驗(yàn)證各基因間的級(jí)聯(lián)調(diào)控關(guān)系以及與性細(xì)胞重塑和性類固醇激素消長(zhǎng)規(guī)律間的互作效應(yīng)，揭示雌性三倍體虹鱒卵巢敗育及其天然性轉(zhuǎn)變的發(fā)生機(jī)制與調(diào)控機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:

4、>　　(1)虹鱒三倍體與二倍體卵巢的分化特征基本一致。虹鱒二倍體與三倍體性腺分別在84dpf和98 dpr已分化為卵巢。但三倍體虹鱒卵巢分化存在障礙，早期發(fā)育停滯，卵原細(xì)胞及其濾泡細(xì)胞數(shù)量有限。在154～574 dpf時(shí)期，二倍體虹鱒卵巢中充滿卵母細(xì)胞，而三倍體卵巢缺少相當(dāng)數(shù)量卵母細(xì)胞，卵巢呈線狀，且在之后的發(fā)育期里一部分雌性生殖細(xì)胞開始去分化。在964 dp耐期，雌性三倍體性腺發(fā)生組織重構(gòu)，并出現(xiàn)再分化現(xiàn)象，性腺中有類似于產(chǎn)精子樣細(xì)胞

5、囊存在，這些細(xì)胞顯得比卵原細(xì)胞略小，與二倍體精巢分化早期生殖細(xì)胞相似。
　　(2)在334～964 dpf時(shí)期，二倍體兩性虹鱒血清中雌二醇和睪酮含量均呈逐漸升高的趨勢(shì)變化，雌性血清雌二醇含量為50～650 pg/ml，較雄性高5～8倍;雄性血清睪酮含量為20～180ng/ml，較雌性高10～25倍。雌性三倍體虹鱒血清雌二醇含量呈先升高后降低趨勢(shì)變化，但其含量始終沒能達(dá)到二倍體水平，峰值為110 pg/ml(574 dpf);雌性三

6、倍體睪酮含量呈逐漸升高趨勢(shì)變化，在發(fā)育后期幾乎達(dá)到了二倍體雄性水平。隨著雌性三倍體虹鱒性腺發(fā)育，卵巢退化較為嚴(yán)重，導(dǎo)致雌激素代謝通路受阻，當(dāng)精巢支持細(xì)胞出現(xiàn)，睪酮被轉(zhuǎn)化為雌二醇的量大大降低。
　　(3)在154～964 dpf時(shí)期，分別以二倍體雌、雄虹鱒作為同期基礎(chǔ)對(duì)照，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)雌性三倍體虹鱒性腺特異基因進(jìn)行差異化表達(dá)分析。研究結(jié)果表明，除Dax1外，在二倍體和三倍體虹鱒性腺中均獲得了Cyp19a1a、Foxl2、s

7、dY，Dmrt1、Amh和Sox9的表達(dá)譜。在雌性三倍體虹鱒性腺中，Cyp19a1a和Foxl2表達(dá)量均呈先升高后降低趨勢(shì)，并顯著低于在二倍體卵巢中的表達(dá)水平(P＜0.05)，只有在154～574 dpf時(shí)期，這兩個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），但他們?cè)谡麄€(gè)發(fā)育期都顯著高于在二倍體精巢中的表達(dá)水平（P＜0.05）;sdY和Dmrt1表達(dá)量均呈先升高后降低趨勢(shì)變化，Amh和Sox9表達(dá)量均呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)，這些基因在574～964 d

8、pf時(shí)期均顯著高于在二倍體卵巢中的表達(dá)水平（P＜0.05）。在發(fā)育早期，雌性三倍體虹鱒sdYDmrt1表達(dá)量顯著低于在二倍體精巢中的水平（P＜0.05），但在574 dpf時(shí)期他們的表達(dá)量達(dá)到最高，且sdY表達(dá)量顯著高于二倍體雄性水平（P＜0.05）;盡管在574～964 dpf時(shí)期，Amh和Sox9的表達(dá)量較二倍體雌性虹鱒高數(shù)百倍，但他們的表達(dá)仍極顯著低于在二倍體精巢中的水平(P＜0.05)。因此，本研究認(rèn)為，Cyp19a1a和Fox

9、l2不斷被下調(diào)或抑制，是導(dǎo)致雌性三倍體卵巢敗育主要因素之一。
　　(4)三倍體雌性虹鱒經(jīng)歷了卵巢發(fā)育停滯、性腺結(jié)構(gòu)重組和性轉(zhuǎn)變過程。在幼魚期，三倍體雌性虹鱒血清雌二醇含量最高，且Foxl2和Cyp19a1a表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，而sdY、Dmrt1、Amh和Sox9表達(dá)量均相對(duì)較低，血清睪酮含量也處于較低水平。但隨著進(jìn)入成年期發(fā)育(784～964 dpf)，僅靠雌激素已無法誘導(dǎo)Foxl2持續(xù)高表達(dá)，而Cyp19a1a的表達(dá)水平也隨之急劇

10、下調(diào);該時(shí)期sdY、Amh和Sox9均持續(xù)高表達(dá)，sdY甚至達(dá)到了同期二倍體雄性的表達(dá)水平，而Foxl2和Cyp19a1a表達(dá)急劇下調(diào)直至微量表達(dá)。
　　(5)本研究是第一次在三倍體雌性虹鱒上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，外源性雄激素和雌激素采用虹鱒養(yǎng)殖業(yè)中的通常劑量。芳香化酶抑制劑（1，4，6-androstatriene-3，17-dione，ATD）處理成功誘導(dǎo)了精巢分化，其發(fā)育模式與二倍體雄性的趨于一致，但精巢發(fā)育速度較慢，不過沒影響其自然生

11、理應(yīng)答。17α-甲級(jí)睪丸酮(17α-methyltestosterone，MET)處理不但沒能產(chǎn)生雄性化誘導(dǎo)效應(yīng)，還將遺傳為雌性的性腺始終抑制在低分化水平，嚴(yán)重阻礙了性腺向任何一個(gè)方向發(fā)展的可能。因此本研究認(rèn)為，三倍體化改變了雌性虹鱒自身雄性化誘導(dǎo)通路的作用機(jī)制。ATD誘導(dǎo)與性腺重構(gòu)的雙重作用觸發(fā)了雌性向雄性逆轉(zhuǎn)，而之后進(jìn)入精巢發(fā)育模式。在三倍體虹鱒卵巢去分化和再分化期進(jìn)行雌激素回救處理，并不能有效促進(jìn)或維持卵巢發(fā)育。
　　(6)

12、本研究依據(jù)雌-雄性轉(zhuǎn)化生物模型來了解三倍體雌性虹鱒的性腺分化特點(diǎn)及其候選基因表達(dá)譜，探索當(dāng)基因組被放大后，雄性化處理對(duì)某些在二倍體中微量表達(dá)的基因的影響效應(yīng)，驗(yàn)證性腺特異基因在卵細(xì)胞發(fā)生去分化和再分化過程中的調(diào)控機(jī)制。通過總體表達(dá)譜可知，在整個(gè)發(fā)育過程中Cyp19a1a和Foxl2的表達(dá)均被ATD所抑制，甚至在發(fā)育后期這兩個(gè)典型的雌性基因也沒能得到有效恢復(fù)。由于雌性基因不斷被下調(diào)或抑制，導(dǎo)致了卵巢敗育，并使卵細(xì)胞去分化返回到性原細(xì)胞時(shí)期

13、;隨著sd，和Dmrt1表達(dá)量不斷上調(diào)，激活了性原細(xì)胞再分化為雄性生殖細(xì)胞，并在Sox9和Amh協(xié)同作用下，開啟了精巢分化模式。MET在三倍體雌性分化過程中不具有對(duì)Cyp19a1a和Foxl2的抑制效應(yīng)，反而是對(duì)其產(chǎn)生了增量調(diào)節(jié)，盡管同時(shí)也上調(diào)了其他雄性特異基因，但由于雌性分化通路并未被完全破壞，導(dǎo)致了雄性化處理失敗。在雌性三倍體性腺去分化和再分化時(shí)期，外源性雌二醇處理破壞了Foxl2與Cyp19a1a級(jí)聯(lián)調(diào)控關(guān)系，并始終抑制Cyp19

14、a1a表達(dá)。由于濾泡層退化或消失，雌性基因絕對(duì)數(shù)量驟減，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源性雌激素合成不足。由于原本Cyp19a1a表達(dá)量就處于較低水平，再加之外源性雌激素強(qiáng)烈抑制，加劇了卵細(xì)胞的去分化進(jìn)程，甚至在再分化期外源性雌激素有促進(jìn)雄性特異基因表達(dá)的情況。說明雌性分化通路中雌激素與Foxl2和Cyp19a1a之間確實(shí)存在反饋調(diào)控關(guān)系。
　　綜上所述，本研究得到以下結(jié)論:(1)三倍體虹鱒卵巢分化同樣由Cyp19a1a與Foxl2共同參與啟動(dòng)，而且

15、受雌激素調(diào)控較為明顯;在其卵巢敗育時(shí)期，sdY和Dmrt1聯(lián)合調(diào)控作用將導(dǎo)致雌性化通路的Cyp19a1a與Foxl2的表達(dá)失調(diào)，而在性轉(zhuǎn)變時(shí)期，Sox9和Amh顯著上調(diào)將對(duì)sdY和Dmrt1表達(dá)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。(2)三倍體虹鱒內(nèi)源性雌激素缺乏是導(dǎo)致卵巢發(fā)育失敗的關(guān)鍵因素。(3)三倍體化破壞了虹鱒雌性化通路的調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致其內(nèi)源性雌激素合成能力不斷下降，進(jìn)而卵巢發(fā)育失敗，并最終發(fā)生了天然雄性化逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。(4)卵細(xì)胞去分化過程對(duì)于Cyp19a