柔嫩艾美耳球蟲β-酮脂酰-ACP還原酶基因的克隆表達(dá)和酶動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或幾種原蟲同時(shí)或先后寄生于雞腸道黏膜細(xì)胞所引起的疾病，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。實(shí)踐證明，抗球蟲藥物使用在雞球蟲的防治上具有重要作用。但抗藥性問(wèn)題限制了現(xiàn)有抗球蟲藥物的廣泛應(yīng)用，促使人們不得不尋找新的藥物靶標(biāo)。II型脂肪酸合成代謝(Type II fatty acid biosynthesis，F(xiàn)ASII)途徑是存在于雞球蟲體內(nèi)的特殊代謝途徑，是研究開發(fā)新型抗球蟲蟲藥物的潛在靶標(biāo)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)出雞球

2、蟲II型脂肪酸合成代謝相關(guān)酶之一-β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase，KR)的ORF序列，進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，分析研究了其酶動(dòng)力學(xué)和抑制動(dòng)力學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)具體分為以下幾個(gè)部分： 首先通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(E. tenalla)β-酮脂酰-ACP還原酶基因(EtKR)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得了EtKR的ORF序列，以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA為模板，用RT-PCR方法成功擴(kuò)增出長(zhǎng)6

3、97bp的EtKR基因部分片段；在此基礎(chǔ)之上，用RACE技術(shù)獲得EtKR基因的全長(zhǎng)cDNA序列；測(cè)序結(jié)果表明，EtKR全長(zhǎng)cDNA共1799bp，5'和3'非編碼區(qū)分別為247bp和508 bp，EtKR ORF長(zhǎng)為1044bp；根據(jù)全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物，成功擴(kuò)增出包含整個(gè)ORF的序列片段。EtKR的ORF編碼一個(gè)由347個(gè)氨基酸組成的多肽，信號(hào)肽預(yù)測(cè)和多序列比對(duì)結(jié)果表明，其N-端包括一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和79個(gè)氨基酸

4、組成的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，成熟的EtKR蛋白共由247個(gè)氨基酸組成，分子量為24.9KD。與其它物種KR的氨基酸序列相似性在35-50％之間，具有保守的三聯(lián)體催化位點(diǎn)(Ser-Tyr-Lys)，屬于短鏈水解還原酶家族。進(jìn)化樹分析表明，EtKR與Pf KR處于同一進(jìn)化枝上。預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的Rossman折疊，與Pf KR的結(jié)構(gòu)最為相似。 利用DNA重組技術(shù)，選擇不同的原核表達(dá)載體(pET-32a(+)、pMAL-c2x)，利用E.co

5、li BL21(DE3)重組表達(dá)EtKR的成熟基因片段，結(jié)果顯示兩個(gè)重組載體都能夠得到表達(dá)；但pET-32a(+)-EtKR重組表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在，pMAL-c2x-EtKR表達(dá)蛋白大部分存在于上清中。純化pMAL-c2x-EtKR表達(dá)的重組蛋白，制備抗體，利用激光共聚焦技術(shù)研究EtKR在E.tenella子孢子內(nèi)的免疫熒光亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，EtKR定位于E.tenella子孢子的頂質(zhì)體，并發(fā)現(xiàn)部分子孢子可能具有多個(gè)頂質(zhì)體。

6、 以pMAL-c2x-EtKR表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)、酶抑制動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果顯示，重組EtKR(rEtKR)不能利用NADPH和AcAcCoA，但是能夠與NADH發(fā)生反應(yīng)，其Km值為72.9μM，這種特性是其它物種的KR所不具有的，我們推測(cè)rEtKR功能改變的原因可能是在細(xì)菌體內(nèi)重組表達(dá)過(guò)程中發(fā)生了非正確折疊，引起rEtKR空間構(gòu)象的改變，從而改變r(jià)EtKR的功能。酶抑制動(dòng)力學(xué)顯示，Hexachlorophene對(duì)rEtKR