多聯(lián)一線抗結(jié)核藥物殼核結(jié)構(gòu)微球的制備及其生物安全性評估.pdf

1、第一章 同軸靜電噴霧技術(shù)制備一線抗結(jié)核藥物殼核結(jié)構(gòu)微球及體外釋放研究
　　目的：
　　探討殼核結(jié)構(gòu)微球的制備條件，制備一線抗結(jié)核藥物殼核結(jié)構(gòu)微球，觀察其體外釋放情況。
　　方法：
　　PLGA和PLLA作為載體材料，利用同軸靜電噴霧法制備載體濃度為5％，7.5％，10％，12.5％的空白微球（內(nèi)泵流量:1.5ml/h，外泵流量:1.5ml/h，電壓:9.5-10.0KV）。利用共聚焦掃描顯微鏡、掃描電鏡觀察微球的

2、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及表征，獲取制備殼核結(jié)構(gòu)微球的最佳制備參數(shù)。根據(jù)上述制備參數(shù)及一線結(jié)核藥物理化性質(zhì)分組:A組:空白殼核微球; B組:異煙肼、鹽酸乙胺丁醇（外殼），利福平、吡嗪酰胺（內(nèi)核）;C組:異煙肼、鹽酸乙胺丁醇（內(nèi)核），利福平、吡嗪酰胺（外殼）制備各組微球。載藥微球進行體外釋放實驗，利用LC-MS/MS檢測各時間點藥物濃度。
　　結(jié)果：
　　(1)最佳PLGA及PLLA濃度:12.5％濃度制備微球出現(xiàn)紡絲現(xiàn)象;5％，7.5％，1

3、0％濃度組激光共聚焦掃描顯微鏡可以觀察到微球呈現(xiàn)殼核結(jié)構(gòu)。掃描電鏡檢查，5％濃度組微球呈現(xiàn)餅狀，7.5％濃度組微球出現(xiàn)表面褶皺，10％濃度組微球表面光滑;
　　(2)微球粒徑:A組微球直徑為18.07±1.174μm，B組微球直徑為18.09±0.800μm，C組微球直徑為18.17±0.903μm;
　　(3)體外釋放:B組，與異煙肼和鹽酸乙胺丁醇對比，利福平、吡嗪酰胺釋放緩慢，存在明顯差異(P＜0.05);C組四種一線結(jié)

4、核藥物呈現(xiàn)同步釋放。
　　結(jié)論：
　　(1)同軸靜電噴霧法制備殼核結(jié)構(gòu)微球最佳載體材料濃度為10％;
　　(2)水溶性藥物（異煙肼、鹽酸乙胺丁醇）包裹在核內(nèi)，脂溶性藥物（利福平、吡嗪酰胺）包裹在殼內(nèi)，四種藥物可以達到同步釋放。
　　第二部分:殼核結(jié)構(gòu)載藥微球?qū)D大鼠BMSCs生物學行為的影響
　　目的：
　　利用SD大鼠BMSCs進行體外生物安全性評估，探討制備的載藥微球是否對BMSCs產(chǎn)生影響。<

5、br>　　方法：
　　雄性SD大鼠(250-300g)脛骨中分離BMSCs，進行傳代培養(yǎng)至P3代，并進行鑒定。分為對照組，空白微球組及載藥微球組，觀察微球?qū)MSCs生長曲線，細胞活性，成骨誘導能力，遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　(1) BMSCs鑒定:88.5％處于細胞周期G0/G1期，6.02％處于細胞周期G2/M期，5.53％處于細胞S期;BMSCs陽性表達CD44，CD90的比例分別為99.34％，98.2

6、3％; CD34，CD45呈陰性表達，陽性表達的細胞分別僅為1.47％，1.56％;
　　(2) BMSCs生長曲線，細胞活性，成骨能力，遷移能力:各組細胞均呈“S”型生長(P＞0.05);MTT檢測，各組細胞在3，6，9天OD值無明顯差異(P＞0.05);經(jīng)成骨誘導2周，各實驗組均出現(xiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)，無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　制備的一線抗結(jié)核藥物殼核結(jié)構(gòu)微球?qū)MSCs的體外生長及成骨、遷移能力無影

7、響，生物相容性好。
　　第三章微球局部植入對SD大鼠骨組織修復的影響研究及藥物的分布情況
　　目的：
　　臨床上骨關節(jié)結(jié)核病灶清除后，進行局部的自體或異體骨移植，重建解剖結(jié)構(gòu)。本研究建立骨缺損模型進行模擬，局部植入制備的微球，探討其是否影響骨組織修復及其藥物的分布情況。
　　方法：
　　SD大鼠脛骨中上段截取2mm長度骨質(zhì)，液氮滅活后回植，建立骨缺損模型。建模動物隨機分為正常組，假手術(shù)組，空白微球組，載藥微

8、球組。2，4，6周隨機選取動物進行影像學，HE染色，B-ALP，TRAP-5b檢查觀察骨組織修復情況;檢測肝腎功能判斷新劑型微球肝腎毒性;檢測局部骨組織、肌肉及外周肝臟腎臟內(nèi)結(jié)核藥物的濃度，判斷藥物在動物體內(nèi)的分布情況。
　　結(jié)果：
　　(1)骨組織修復情況:與假手術(shù)組對比，空白微球組，載藥微球組在2，4，6周行X片檢查未見明顯骨缺損愈合延遲或者不愈合;組織切片中觀察截骨端變化情況，2周出現(xiàn)骨膜增生，4周缺損部位出現(xiàn)新生骨質(zhì)

9、并向?qū)?cè)生長，6周骨缺損部位形成明顯的骨性連接;手術(shù)干預的動物B-ALP，TRAP-5b較正常動物明顯增高(P＜0.05)，各組建模動物各時間點未見明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)肝腎毒性:與正常動物對比，假手術(shù)組，空白微球組，載藥微球組動物肝腎功能指標未見明顯升高(P＞0.05)。
　　(3)藥物分布:肝臟、腎臟組織內(nèi)未檢測到四種結(jié)核藥物，局部骨組織和肌肉組織內(nèi)，2，4，6周均可檢測到四種結(jié)核藥物，并局部濃度高于各結(jié)