細粒棘球絳蟲原頭蚴mRNA測序及生物信息學分析.pdf

1、目的:通過對細粒棘球絳蟲原頭蚴總mRNA進行測序及對測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析,期望揭示細粒棘球絳蟲原頭蚴轉(zhuǎn)錄組遺傳信息,為深入了解細粒棘球絳蟲原頭蚴轉(zhuǎn)錄組的生物學特征及其與宿主之間的關系,提供新的包蟲病的診斷方法、篩選新的藥物靶點和疫苗候選分子,提供了研究數(shù)據(jù),積累了研究資料。
　　方法:1.外科手術剝離包蟲病人的包囊并分離原頭蚴,用TRIzol加液氮研磨法提取原頭蚴總RNA,檢測總RNA的質(zhì)量。2.用帶有Oligo(dT)的磁珠

2、富集poly(A)mRNA,分離出不少于500ng的原頭蚴總mRNA。分離出來的總mRNA被反轉(zhuǎn)錄成一鏈和二鏈cDNA,并將cDNA片段化,通過QIAquickPCRPurificationKit純化,純化后進行末端補平,向補平后二鏈cDNA的3’端加入堿基腺嘌呤(A),添加接頭后的連接產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠回收目的片段并加以純化,通過PCR富集cDNA模板后回收PCR產(chǎn)物并加以純化,用Agilent2100檢驗文庫質(zhì)量。3.構建好的文庫

3、用Illumina公司HiSeq2000高通量測序儀進行測序。4.利用Mapping-first方法對測序所得數(shù)據(jù)進行組裝與拼接,最終形成unigene。5.用生物信息學方法對所得到的unigene進行注釋,包括與NCBI網(wǎng)站中非冗余的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(Non-redundant,Nr)、全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫(UniversalProtein,UniProt)、基因本體數(shù)據(jù)庫(GeneOntology,GO)以及日本京都基因和基因組百科全書

4、通路數(shù)據(jù)庫(KEGGPathway)進行比對,得到具有最高序列相似性的蛋白,從而得到該unigene的蛋白功能注釋信息。
　　結果:1.經(jīng)核酸蛋白微量分析儀測定總RNAOD260/OD280=1.81,conc=42.75μg/ml,符合測序要求。2.通過測序共獲得132007609條reads(4Gb),每條reads的平均長度為101bp,其中可用reads的比例為76.1%,Mappingreads的比例為92.8%。這些r

5、eads經(jīng)過組裝后共形成91342條unigene,平均長度為419bp,GC含量為43.78%。3.注釋結果顯示,比對到Nr數(shù)據(jù)庫的unigene為11866條,比對到UniProt數(shù)據(jù)庫的unigene為11294條。通過對基因進行GO分類注釋,獲得了GO功能注釋信息,分別歸入到了生物學過程、分子功能和細胞組分3個主要類別,這3個主要類別又被劃分為48個更為詳細的功能組。通過KEGGpathway的注釋,共有6664條unigene