細粒棘球絳蟲原頭節(jié)和囊壁抗原篩選與烯醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)篩選出細粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁蛋白中有望成為免疫學(xué)診斷抗原的分子，為早期診斷包蟲病提供一定理論基礎(chǔ)。
　　方法：提取細粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁組織蛋白，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，借助蛋白質(zhì)印跡技術(shù)初步掌握細粒棘球絳蟲原頭節(jié)、囊壁蛋白表達譜及免疫原性；利用二維電泳技術(shù)分離原頭節(jié)、囊壁蛋白，選取原頭節(jié)40個蛋白點、囊壁8個蛋白點切膠，胰蛋白酶酶解，利用基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)

2、獲得各個蛋白點的肽指紋圖譜數(shù)據(jù)，應(yīng)用Mascot軟件檢索NCBInr、SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)鑒定；通過查閱文獻結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)初步分析，選取質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果中有望成為候選抗原分子的烯醇酶、轉(zhuǎn)酮醇酶，利用生物信息學(xué)軟件從理化性質(zhì)、信號肽、B/T細胞表位、空間結(jié)構(gòu)，亞細胞定位等分析烯醇酶、轉(zhuǎn)酮醇酶成為特異性診斷抗原的可能性。構(gòu)建烯醇酶、轉(zhuǎn)酮醇酶原核表達載體，獲得純化蛋白為后期實驗提供一定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：1.原頭節(jié)

3、蛋白質(zhì)在分子量72KD左右有大量濃集，囊壁的蛋白質(zhì)濃集在72kD、26kD和17kD左右；2.原頭節(jié)、囊壁中分別有36、6個蛋白點得到鑒定，大致可以分為：（1）細胞骨架蛋白（2）代謝相關(guān)酶類（3）細胞信號傳導(dǎo)通路蛋白（4）物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白（5）熱休克蛋白（6）蛋白翻譯有關(guān)蛋白等；3.烯醇酶基因全長1449bp，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，CDS為1302bp，編碼434個氨基酸；相對分子量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)分別為46.56kD、6.

4、48、32.97，半衰期較長，為穩(wěn)定蛋白；烯醇酶親水性、柔性區(qū)域、抗原性、表面可及性得分較高的氨基酸區(qū)域分別有9、12、19、8個；可能的B細胞線性表位有15個；CTL細胞表位和Th細胞表位各有10個；二級結(jié)構(gòu)中主要以α螺旋、無規(guī)則卷曲為主；與人類烯醇酶氨基酸序列一致性為66.23％。轉(zhuǎn)酮醇酶基因由7個外顯子，6個內(nèi)含子構(gòu)成，CDS為1878 bp，編碼625個氨基酸；相對分子量為67.76 kD；預(yù)測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)酮醇酶可能為跨膜蛋白，位

5、于細胞質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋、無規(guī)則卷曲為主；有16個潛在的B細胞線性表位，11個CTL細胞表位，13個 Th細胞表位；與人類轉(zhuǎn)酮醇酶一致性僅為58.68%；4.成功構(gòu)建pet28a-EgEN、pet28-EgTK原核表達載體，并獲得重組蛋白，EgEn、EgTK與CE病人血清反應(yīng)陽性率均大于75%，CE與AE有部分交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：初步鑒定了細粒棘球蚴原頭節(jié)、囊壁組織中的部分蛋白點，這些蛋白主要參與代謝、細胞骨架、信號傳導(dǎo)、