以GPR40受體為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型建立和唐順平對高脂喂養(yǎng)C57小鼠胰島素抵抗的改善作用及其機(jī)制探討.pdf

1、隨著飲食習(xí)慣和生活方式的改變,肥胖、胰島素抵抗、糖尿病的發(fā)病率迅猛增長,嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量?，F(xiàn)有口服降糖藥物的副作用以及其治療無效的病例不斷增加,使得研發(fā)新型安全有效的抗糖尿病口服藥物,成為藥物研發(fā)攻關(guān)的焦點(diǎn)。GPR40是新近發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,主要分布于胰腺β-細(xì)胞。研究證實(shí)GPR40是中、長鏈游離脂肪酸(FFAs)的受體,是介導(dǎo)FFAs的“增強(qiáng)葡萄糖刺激胰島素分泌”作用的主要途徑。激活GPR40受體,可以降

2、低血糖,其優(yōu)點(diǎn)是“糖依賴性”,較少或幾乎不引起低血糖反應(yīng)。因此,GPR40已逐步成為治療糖尿病的新靶點(diǎn)之一,針對于該靶點(diǎn)的小分子GPR40激動(dòng)劑的尋找已經(jīng)成為國內(nèi)外研發(fā)治療2型糖尿病藥物的新熱點(diǎn)。本研究致力于建立以GPR40信號通路為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型,用于發(fā)現(xiàn)GPR40受體激動(dòng)劑類的新型抗糖尿病藥物。胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖、心血管疾病以及動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。深入研究胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的機(jī)理,尋找理

3、想的胰島素增敏劑已成為各國科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。胰島素抵抗病因復(fù)雜,中藥復(fù)方多成分,多靶點(diǎn)的作用,在改善胰島素抵抗方面有著極大的優(yōu)勢與潛力。唐順平是本實(shí)驗(yàn)室在金芪降糖片的研究基礎(chǔ)上提取各單味藥(黃連、黃芪和金銀花)的有效部位重新組成的復(fù)方,本文旨在觀察其在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型的作用并探討其可能的作用機(jī)制
　　 第一部分成功建構(gòu)了以人源GPR40信號通路為靶點(diǎn)的HEK293細(xì)胞模型。首先利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒

4、:人源GPR40蛋白跨膜表達(dá)質(zhì)粒:Peak13-CD5L-hGPR40；受GPR40下游信號調(diào)控的hElk1激活結(jié)構(gòu)域與Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒:pCMV-hElk1-Gal4-tag5A；以及6拷貝的Gal4應(yīng)答元件調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒:Peak12-6×Gal4-luci。然后,將三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株,加入不同濃度的內(nèi)源性、外源性GPR40激動(dòng)劑,以驗(yàn)證該細(xì)胞模型對GPR40激動(dòng)劑的反應(yīng)

5、性和特異性。結(jié)果顯示,該細(xì)胞模型對GPR40的內(nèi)源性配體--軟脂酸以及人工合成GPR40小分子激動(dòng)劑——GW9508的激活反應(yīng)靈敏,具有特異性。目前,已將這種細(xì)胞模型用于GPR40激動(dòng)劑篩選工作中,而進(jìn)一步的優(yōu)化工作也正在進(jìn)行中,目的是使該細(xì)胞模型應(yīng)用于高通量篩選。
　　 第二部分評價(jià)了唐順平對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。高熱量、高脂飲食喂養(yǎng)雄性成年C57BL/6J小鼠(HF-C57)3-4月

6、,可以誘發(fā)胰島素抵抗。該模型具有明顯肥胖、空腹血糖升高、血脂紊亂,同時(shí)伴有葡萄糖耐量異常,胰島素耐量異常,高胰島素血癥等類似人類2型糖尿病的特征,是一種較為理想的具有人類胰島素抵抗病理特征的動(dòng)物模型,適用于尋找胰島素增敏劑的開發(fā)研究。唐順平可以明顯改善模型動(dòng)物的胰島素抵抗癥狀:主要表現(xiàn)在能夠改善胰島素耐量異常、葡萄糖耐量異常,增加高血糖鉗夾的葡萄糖輸注速率,改善高胰島素血癥、增加胰島素敏感指數(shù)。其可能通過降低體重,減少異位脂肪堆積,改善