LOC66273變異剪接體2對3T3-L1前脂肪細胞成脂變化和增殖凋亡的影響.pdf

1、第一部分 LI-2基因生物信息學分析及細胞定位
　　 [目的]初步了解LI-2基因及蛋白的結構、功能和亞細胞定位，研究LI-2基因及蛋自在小鼠各組織分布情況，為后續(xù)研究提供基礎。
　　 [方法]運用生物信息學方法分析LI-2基因及蛋白的結構和功能，在熒光顯微鏡下觀察其亞細胞定位。采用半定量RT-PCR檢測小鼠各組織LI-2基因mRNA水平，Western-blot免疫印跡法檢測小鼠各組織LI-2蛋白表達水平。CREB熒光

2、素酶反式報告檢測系統(tǒng)的高通量篩選技術篩查與CREB相互作用的調控基因。
　　 [結果](1)小鼠LI-2基因位于染色體7E2上，可譯框架為789bp，編碼122個氨基酸，預測分子量為13.2kDa，等電點為7.77；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，LI-2基因在多種物種體內高度保守，但與任何已知基因和蛋白質沒有明顯同源性。保守域分析表明，LI-2中有一個預測的Mth938結構域(氨基酸殘基5-120)；(2)LI-2基因在脂肪、骨骼肌、小腸、

3、肺及腎臟組織均有表達，但在脂肪和骨骼肌組織表達較高；LI-2的亞細胞定位提示，GFP-L12融合蛋白在細胞質中彌漫分布，并在核周圍有一些高度集中點；(3)CREB熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)結果提示過表達LI-2增加了CREB的活性，其活性是空白對照組的2.5倍。
　　 [結論]LI-2基因在多種物種體內高度保守，提示了它具有重要的功能。LI-2在白色脂肪組織高表達，同時基于定量的CREB熒光素酶反式報告檢測系統(tǒng)的高通量功能性篩選平

4、臺顯示了與CREB轉錄活性相關的基因中包括LI-2基因。這些信息都提示了LI-2基因可能與成脂分化有關。
　　 第二部分 LI-2在MDI誘導3T3-L1細胞成脂分化過程中的表達變化
　　 [目的]研究MDI三聯(lián)誘導3T3-L1前脂肪細胞成脂分化過程中LI-2變化情況。
　　 [方法]本部分實驗通過油紅染色、Western-Bloting印跡、半定量RT-PCR等實驗技術觀察研究MDI三聯(lián)誘導3T3-L1前脂肪細

5、胞成脂0、2、4、8天細胞形態(tài)、脂滴沉積和LI-2基因mRNA及蛋白水平變化情況。
　　 [結果](1)MDI誘導3T3-L1前脂肪細胞2d后，細胞逐漸變圓變亮，梭形前脂肪細胞逐漸變?yōu)闄E圓形，胞漿內可見油紅0染成亮紅色的少量脂滴，誘導分化6d，胞核四周出現(xiàn)較大脂滴；誘導分化后8d，可見90％以上細胞具有成熟脂肪細胞表型。(2)半定量RT-PCR結果顯示MDI三聯(lián)誘導4d后，3T3-L1前脂肪細胞的LI-2 mRNA水平顯著升高(

6、P<0.05)，并在分化過程中持續(xù)增長；Western blot結果顯示3T3-L1前脂肪細胞內的IL-2蛋白水平隨著分化逐漸增多，誘導第4天變化明顯，有顯著差異(P<0.05)。
　　 [結論]用經(jīng)典的雞尾酒MDI三聯(lián)誘導可以成功的建立3T3-L1前脂肪細胞成脂分化模型，為后續(xù)實驗奠定基礎。隨著3T3-L1前脂肪細胞分化，我們發(fā)現(xiàn)LI-2基因的mRNA和蛋白水平均較分化早期明顯升高，這進一步證實了LI-2與細胞成脂分化相關。<

7、br>　　 第三部分過表達LI-2對3T3-L1細胞增殖和分化的影響
　　 [目的]在細胞過表達LI-2的情況下，研究LI-2對3T3-L1細胞成脂分化及細胞增殖和凋亡的影響。
　　 [方法](1)用pcDNA3.1-LI2質粒轉染3T3-L1前脂肪細胞，用倒置顯微鏡分別觀察轉染質粒pcDNA.3.1-LI2，轉染pcDNA.3.1空白載體以及MDI誘導的未轉染任何質粒的三組3T3-L1前脂肪細胞的細胞形態(tài)變化，并用油

8、紅染色觀察細胞脂滴沉積情況；(2)細胞增殖活力檢測(MTT法)檢測上述三組細胞連續(xù)培養(yǎng)8天增殖情況：(3)用流式細胞儀檢測分析LI-2對細胞凋亡的影響；(4)用流式細胞儀對上述三組細胞進行細胞周期檢測；(5)采用實時熒光定量PCR和Western blot免疫印跡法檢測過表達LI-2對3T3-L1細胞成脂分化相關基因的mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　 [結果](1)過表達LI-2的3T3-L1前脂肪細胞在沒有MDI三聯(lián)誘導下

9、，可見細胞逐漸變圓變亮，梭形成纖維細胞逐漸變?yōu)闄E圓形，與MDI誘導的3T3-L1前脂肪細胞變化類似，均發(fā)生了脂肪分化，僅轉染pcDNA.3.1空白載體的3T3-L1前脂肪細胞形態(tài)未有明顯變化。用油紅O細胞染色可見，三組細胞培養(yǎng)8天后，pcDNA.3.1-LI2轉染3T3-L1前脂肪細胞和MDI誘導的3T3-L1前脂肪細胞在低倍鏡和高倍鏡下觀察均可見大片亮紅的脂滴，但pcDNA.3.1空白載體轉染的3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)8天后僅見極少

10、數(shù)脂滴；(2)用MTT法檢測空白對照組、轉染pcDNA.3.1-LI2質粒組和轉染peDNA.3.1空白載體組細胞存活率，結果提示轉染pcDNA.3.1-LI2質粒組的細胞存活率相對于其他兩組在轉染后4、6、8天時間點均明顯下降(P<0.05)；(3)流式細胞儀在分析細胞周期分布提示轉染pcDNA.3.1空白載體的細胞，在用血清處理24小時或36小時后，S時期和G2/M時期的細胞數(shù)量大大增長。相反地，在血清處理24小時或36小時后，處于

11、S時期和G2/M時期的LI2過表達的3T3-L1細胞的比例幾乎沒有變化(P<0.05)；(4)流式細胞儀測轉染2天和4天三組細胞凋亡率，結果提示三組細胞4天細胞凋亡率均較2天增多，但各組間無明顯差異；(5)成脂分化的兩個關鍵基因PPARγ和C/EBPα的mRNA水平在pcDNA3.1-LI2轉染的3T3-L1前脂肪細胞中高于空白載體對照組，有顯著差異(P<0.05)，基因水平也隨著培養(yǎng)天數(shù)逐漸升高；Western blot檢測3T3-L

12、1前脂肪細胞在轉染pcDNA3.1-LI-2或pcDNA3.1空白載體后4天和8天的PPARγ、C/EBPα、PREF-1、GADD153、α FABP和FAS的蛋白水平，結果提示，細胞轉染后4天和8天，過表達LI-2細胞的促成脂基因PPARγ、C/EBPα和助于脂肪酸轉運、合成的α-FABP、FAS蛋白表達水平明顯高于空白載體對照組，而其抑制前脂肪細胞分化的Pref-1和GADD153蛋白表達水平明顯低于空白載體對照組。
　　

13、 [結論]LI-2在促進促成脂調節(jié)因子的表達的同時也會抑制成脂負調節(jié)因子的表達，有利于成脂分化的進行。另外LI-2可以抑制前脂肪細胞增殖，有促進前細胞進入成脂分化的作用，但在本部分實驗未觀察到LI-2對于細胞凋亡的影響，我們將進一步研究沉默LI-2對于細胞凋亡的影響。
　　 第四部分沉默LI-2對3T3-L1細胞凋亡和分化的影響
　　 [目的]通過沉默LI-2基因來進一步探索LI-2與3T3-L1前脂肪細胞凋亡和分化的關

14、系及具體機制，從正反兩個方面來闡明這一論題。
　　 [方法](1)用siRNA干擾片段轉染3T3-L1前脂肪細胞，用倒置顯微鏡分別觀察轉染siRNA干擾片段轉染組及轉染陰性對照non-siRNA質粒組的細胞形態(tài)變化，并用油紅染色觀察細胞脂滴沉積情況；(2)用Hoechst33342試劑細胞染色后在熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，并用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡；(3)Ac-DEVD-AMC分析各組細胞在不同時間 easpase-3的活

15、性和用Western blot免疫印跡法檢測caspase-3蛋白表達水平；(4)CREB雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)分析沉默LI-2對CREB活性的影響，同時采用Western blot免疫印跡法檢測CREB和p-CREB的蛋白表達水平；(5)采用實時熒光定量PCR和Western blot免疫印跡法檢測沉默LI-2對3T3-L1細胞成脂分化相關基因的mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　 [結果](1)沉默LI-2的兩組3T3-L1

16、前脂肪細胞在MDI三聯(lián)誘導下，細胞形態(tài)未有明顯變化，而MDI誘導的陰性對照組的3T3-L1前脂肪細胞逐漸變圓變亮，梭形成纖維細胞逐漸變?yōu)闄E圓形，發(fā)生了脂肪分化。用油紅O細胞染色可見，三組細胞培養(yǎng)8天后，siLI-2-1、siLI-2-2轉染的3T3-L1前脂肪細胞僅見極少數(shù)脂滴，MDI誘導的陰性對照組細胞在低倍鏡和高倍鏡下觀察均可見大片亮紅的脂滴；(2)3T3-L1前脂肪細胞轉染siLI-2-1、siLI-2-2或non-siRNA后2

17、天，開始MDI三聯(lián)誘導4天后，熒光顯微鏡可觀察到轉染siLI-2-1、siLI-2-2細胞胞核皺縮，呈碎片狀，邊緣化，且有凋亡小體形成，而轉染non-siRNA的細胞胞核形態(tài)完整；流式細胞儀檢測轉染2天和4天三組細胞凋亡率，結果提示，沉默LI-2的兩組細胞在MDI三聯(lián)誘導下，凋亡率相對于陰性對照組明顯升高；(3)上述三組細胞在MDI三聯(lián)誘導4天后，根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，測定caspase-3的活性結果提示，沉默LI-2的兩組細

18、胞在MDI三聯(lián)誘導下，caspase-3的活性相對于陰性對照組明顯升高，同時Western blot免疫印跡法檢測結果顯示caspase的蛋白表達水平也明顯高于陰性對照組；(4)CREB熒光素酶反式報告檢測系統(tǒng)的檢測結果顯示轉染后，用MDI三聯(lián)誘導三組細胞2天和4天發(fā)現(xiàn)，沉默LI-2組的相對熒光素酶活性要明顯低于陰性對照組(P<0.05)；western bloting檢測各組細胞的CREB和pCREB蛋白表達水平的結果提示，LI-2基

19、因沉默組的細胞pCREB蛋白表達水平要明顯低于陰性對照組(P<0.05)，但三組細胞的CREB蛋白表達水平無顯著差異；(5)沉默LI-2基因抑制3T3-L1前脂肪細胞細胞PPARγ和C/EBPα基因mRNA和蛋白表達水平，同時也抑制了助于脂肪酸轉運、合成的α FABP、FAS蛋白表達，但成脂負調控因子Pref-1和GADD153蛋白表達水平明顯高于陰性對照組。
　　 [結論]LI-2一方面通過調節(jié)某些轉錄因子的表達促進細胞成脂分