負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞的受體耐受性樹突狀細(xì)胞延長協(xié)調(diào)性異種胰島移植物存活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著Edmonton方案的出臺(tái)，胰島移植已成為一種使1型糖尿病患者擺脫胰島素依賴的安全有效的治療方法，但該方案要求每個(gè)受者至少要接受2個(gè)以上供體的胰島才能恢復(fù)血糖正常，這更加劇了供體短缺，胰島來源有限已成為當(dāng)前胰島移植的主要障礙。異種胰島有望改善胰島匱乏的局面，但其面臨強(qiáng)烈的反應(yīng)，目前抑制排斥反應(yīng)的常用方法就是大劑量的免疫抑制劑，但其為非特異性免疫抑制，有繼發(fā)感染、腫瘤的危險(xiǎn)。誘導(dǎo)抗原特異性耐受是器官移植中的理想策略，也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)

2、。異種胰島移植排斥反應(yīng)主要由抗原識別“間接途徑”激活的T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是唯一能夠激活初始T細(xì)胞反應(yīng)的抗原遞呈細(xì)胞，在激發(fā)免疫應(yīng)答或在誘導(dǎo)免疫耐受中DC起著樞紐作用，其功能主要與其成熟狀態(tài)有關(guān)。未成熟DC能有效提呈凋亡細(xì)胞抗原并轉(zhuǎn)向成熟。近期研究顯示，細(xì)胞因子信號抑制因子-1(suppressorofcytokinesignaling1，SOCS1)在抑制DC活化中起重要作用，因此，通過基因

3、轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)SOCS1的表達(dá)能抑制DC成熟，維持其耐受原性。本研究中，我們用SOCS1基因修飾的受體DC負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞，然后于胰島移植前7天注入受體，觀察能否誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受及延長異種胰島移植物存活時(shí)間，本研究分以下七部分： 第一部分：小鼠SOCS1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定 目的：構(gòu)建含小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體，并予以鑒定。 方法：以pEF-FLAG-1/mSOCS1質(zhì)粒為模版，PCR擴(kuò)增SO

4、CS1序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)AgeI和NheI酶切，再定向插入到AgeI和NheI酶切的pDC316-LacZa質(zhì)粒中，獲得穿梭質(zhì)粒pDC316-SOCS1，經(jīng)PCR、AgeI和NheI酶切及測序等鑒定后，用脂質(zhì)體將穿梭質(zhì)粒pDC316-SOCS1與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGF35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)位點(diǎn)特異性重組獲得含目的基因的重組腺病毒Ad5F35-SOCS1，行PCR鑒定，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、純化制備高滴度病毒液，TCID50法測定病毒滴度

5、。 結(jié)論：成功構(gòu)建了含小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體，為基因轉(zhuǎn)染制備耐受性樹突狀細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定 目的:建立一種簡單經(jīng)濟(jì)的體外擴(kuò)增、培養(yǎng)小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(bonemarrowderiveddendriticcell，BM-DC)的方法，并從形態(tài)學(xué)、免疫表型和細(xì)胞功能方面予以鑒定。 方法：分離小鼠骨髓中DC前體細(xì)胞，用5ng/ml重組小鼠粒細(xì)胞.巨噬

6、細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)來擴(kuò)增、培養(yǎng)小鼠BM-DC。培養(yǎng)體系分4天組和8天組組。培養(yǎng)第4天，收集疏松貼壁的細(xì)胞即為DC，用倒置顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察其形態(tài)特征，流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞表型，通過抗原吞噬實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來觀察其生物學(xué)功能。 結(jié)論:用rmGM-CSF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得小鼠BM-DC。 第三部分：SOCS1基因轉(zhuǎn)染對小鼠樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的：研究SOCS1基

7、因轉(zhuǎn)染對小鼠樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法：用攜帶小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠DC，用免疫組化和Westernblot檢測DC中SOCS1的表達(dá)。用FCM檢測DCs的細(xì)胞表型變化，通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)觀察DCs對T細(xì)胞增殖的影響，以ELISA檢測細(xì)胞因子分泌水平，實(shí)驗(yàn)分為對照組、Ad-EGFP組、Ad-SOCS1組。 結(jié)論：SOCS1基因轉(zhuǎn)染能抑制DCs成熟，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向分化，是制備

8、耐受性DCs的有效方法。 第四部分：SOCS1基因轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞負(fù)載大鼠凋亡脾細(xì)胞后的免疫特性研究 目的：研究SOCS1基因修飾的小鼠樹突狀細(xì)胞負(fù)載大鼠凋亡脾細(xì)胞后的免疫特性。 方法：用紫外線照射的方法來誘導(dǎo)大鼠脾細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞凋亡。將大鼠凋亡脾細(xì)胞(Apo-SCs)與SOCS1基因轉(zhuǎn)染的小鼠DC(SOCS1-DC)共培養(yǎng)48h，以使SOCS1-DC負(fù)載Apo-SCs(SOCS1-Apo-SCsDC

9、)。FCM檢測DC負(fù)載Apo-SCs前后共刺激分子的表達(dá)，通過初次MLR了解SOCS1-Apo-SCsDC刺激T細(xì)胞增殖的能力，用SOCSl-Apo-SCsDC預(yù)致敏小鼠后行再次MLR，觀察SOCS1-Apo-SCsDC能否誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞低反應(yīng)性。 結(jié)論：SOCS1基因修飾的小鼠樹突狀細(xì)胞負(fù)載大鼠凋亡脾細(xì)胞后可誘導(dǎo)T細(xì)胞抗原特異性低反應(yīng)性。 第五部分：大鼠胰島的分離、純化及鑒定 目的：對大鼠胰島分離、純化條

10、件進(jìn)行優(yōu)化，為下一步胰島移植實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：通過膽總管逆行灌注膠原酶P溶液來消化大鼠胰腺，分離胰島，采用不連續(xù)密度梯度Ficoll離心法純化胰島，觀察膠原酶濃度、消化時(shí)間對大鼠胰島分離結(jié)果的影響。雙硫腙染色鑒定胰島，丫啶橙/碘丙啶染色鑒定胰島細(xì)胞活率，糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)評價(jià)胰島功能。 結(jié)論：膠原酶濃度、消化時(shí)間影響胰島分離結(jié)果，優(yōu)化分離條件可改善大鼠胰島分離結(jié)果，1mg/ml膠原酶P靜止消化45分鐘條件下胰島分離

11、效果較好。第六部分糖尿病小鼠異種胰島移植模型的建立和療效觀察 第六部分：糖尿病小鼠異種胰島移植模型的建立和療效觀察 目的：建立糖尿病小鼠模型及大鼠對小鼠異種胰島移植模型，觀察異種胰島移植對小鼠糖尿病的療效。 方法：采用單次腹腔注射鏈脲霉素(200mg/kg)來制備糖尿病小鼠模型，以非空腹血糖連續(xù)超過16.7mmol/L視為造模成功。將600個(gè)大鼠胰島移植到糖尿病小鼠腎被膜下，觀察異種胰島移植物的功能，以非空腹血糖

12、連續(xù)超過11.2mmol/L視為移植物被排斥，功能喪失，并通過組織病理學(xué)觀察異種胰島移植物形態(tài)學(xué)的變化。 結(jié)論：成功建立糖尿病小鼠異種胰島移植模型，為研究異種胰島移植排斥或耐受奠定了基礎(chǔ)。 第七部分：SOCS1基因修飾的受體樹突狀細(xì)胞負(fù)載供體凋亡細(xì)胞延長協(xié)調(diào)性異種胰島移植物存活的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞的受體耐受性樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)協(xié)調(diào)性異種胰島移植耐受中的作用。 方法：建立Lewis大鼠對C

13、57BL/6小鼠腎被膜下異種胰島移植模型。胰島移植前7天經(jīng)尾靜脈輸注2×106個(gè)不同方法處理的受體DC來預(yù)處理受體小鼠，據(jù)輸注DC的不同將實(shí)驗(yàn)分為6組：①對照組：單純注射磷酸鹽緩沖液；②DC組：單純受體DC；③SOCS1-DC組：SOCS1基因轉(zhuǎn)染的受體DC：④Apo-SCsDC組：負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞(Apo-SCs)的受體DC；⑤SOCS1-Apo-SCsDC組：負(fù)載供體Apo-SCs且已轉(zhuǎn)染SOCS1基因的受體DC；⑥無關(guān)第三供體組

14、：SD大鼠為供體，余處理同第5組。觀察各組胰島移植物存活時(shí)間及組織病理學(xué)改變，非空腹血糖低于11.2mmol/L視為血糖正常，血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/L視為移植物排斥，功能喪失。 結(jié)論：SOCS1基因修飾的受體DC負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞可延長協(xié)調(diào)性異種胰島移植物存活時(shí)間。 總結(jié)：轉(zhuǎn)染SOCS1基因能抑制DC成熟，SOCS1基因修飾的受體DC負(fù)載供體凋亡脾細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞抗原特異性低反應(yīng)性，并能延長協(xié)調(diào)性異種胰島移植