PRPS1基因打靶載體的構(gòu)建及Treacher collins綜合征致病基因篩查.pdf

1、耳聾是導(dǎo)致言語交流障礙的常見疾病,由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起，在所有耳聾患者中由于遺傳因素導(dǎo)致的約占60％，主要表現(xiàn)為單基因遺傳病。中國耳聾的發(fā)病率高、數(shù)量多、危害大，快速提高耳聾的防治水平對降低耳聾的發(fā)生率至關(guān)重要。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展及人民生活水平的提高，導(dǎo)致耳聾的各種外界環(huán)境因素的影響正在逐步減弱，遺傳因素在耳聾病因?qū)W中的重要性日漸突出。近年來，隨著分子遺傳學(xué)研究高速發(fā)展，我們對于聽覺功能和耳聾病因的理解越來越深入，一部分研究成果已

2、應(yīng)用于臨床實踐。但仍有許多致聾基因的功能及發(fā)病機制還不明確，深入地研究遺傳性耳聾的病因和發(fā)病機理，尋找能夠預(yù)測、減少后代耳聾再發(fā)風(fēng)險的預(yù)防措施及新的耳聾治療方法，對于降低耳聾的發(fā)生率、提高我國人口素質(zhì)有重要的現(xiàn)實和長遠意義。本工作針對遺傳性耳聾進行了病因及發(fā)病機理的研究，分為兩部分。
　　一、PRPS1基因打靶載體的構(gòu)建及ES細胞的篩選和鑒定
　　本課題組在前期研究中，在國際上首次發(fā)現(xiàn)PRPS1基因缺陷可導(dǎo)致DFNX1型耳聾

3、并初步揭示了其致聾機制，通過國際國內(nèi)協(xié)作我們在英國、美國和另一中國DFNX1耳聾家系中均找到了PRPS1致病基因突變，證實了這一重要發(fā)現(xiàn)。通過對PRPS1致聾機制的研究，我們發(fā)現(xiàn)通過藥物干預(yù)有可能實現(xiàn)DFNX1型耳聾的癥狀前預(yù)防（PRPS1是體內(nèi)嘌呤和嘧啶核苷酸從頭合成途徑的重要酶類），并找到了比較理想的候選藥物S-腺苷蛋氨酸（SAM），評估SAM對DFNX1型耳聾可能的療效和安全性則需要在動物模型上進行驗證。本研究利用基于ES細胞和定

4、點同源重組原理的基因打靶技術(shù)建立DFNX1基因敲入載體，在129品系ES細胞基因組中置入與人類DFNX1突變同源的c.869T>C突變。以長短兩段目的基因的同源序列構(gòu)建載體，同源序列之間插入突變位點和loxP序列錨定的正選擇篩選的neo基因。載體構(gòu)建成功后，將線性化的載體DNA電轉(zhuǎn)至ES細胞，通過同源重組技術(shù)整合到ES細胞基因組序列，利用抗生素G418和長片段PCR聯(lián)合篩選的方法，剔除未發(fā)生整合和隨機插入載體序列的ES細胞，并進行陽性E

5、S細胞的篩選。該載體的構(gòu)建，為DFNX1小鼠模型的建立、PRPS1基因功能研究、致聾機制、發(fā)病前預(yù)防、藥物篩選等關(guān)于該疾病的后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)。
　　二、TreacherCollins綜合征致病基因篩查
　　TreacherCollins綜合征（TreacherCollinssyndrome,TCS）又稱為Franceschetti綜合征、Franceschetti-Zwahlen-Klein綜合征，是一種影響面部發(fā)育的

6、常染色體顯性遺傳性疾病，因此也稱為下頜面骨發(fā)育不全（MandibulofacialDysostosis,MFD），其主要臨床表現(xiàn)為顱面骨發(fā)育不全包括顴骨和下頜發(fā)育不良、小耳畸形、外耳道閉鎖、瞼裂外下垂或巨口等，患者有特征性的魚臉樣面容。本研究對一例TCS疑似病例進行了TCOF1基因的直接測序，發(fā)現(xiàn)該患者攜帶TCOF1的第11外顯子c.1639delAG雜合突變，此突變提前產(chǎn)生了終止密碼子(p.S547X)，對其父親、母親進行該基因位點突