bFGF、rhBMP-2聚乳酸納米微球促進(jìn)下頜骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、頜面部骨折是口腔頜面外科的常見(jiàn)病和多發(fā)病。隨著我國(guó)交通事故的發(fā)生率逐年遞增，頜面部骨折的發(fā)生率也逐年增加。對(duì)頜面部骨折的診治的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。頜面部骨折同全身其他部位骨折相比，其獨(dú)特性有：復(fù)位和固定時(shí)要求更嚴(yán)格；在復(fù)位固定后，也往往因限制進(jìn)食影響到骨折的愈合；必須在功能恢復(fù)的基礎(chǔ)上滿足患者對(duì)外觀的要求。因此，頜面部骨折的治療必須要求嚴(yán)格的復(fù)位和固定，并力求骨折盡可能快地愈合。 分子生物學(xué)研究表明，骨折愈合是一個(gè)多

2、種細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)與骨折愈合密切相關(guān)。bFGF對(duì)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的增殖和分化都有明顯的刺激作用，因而在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BMP-2是骨折修復(fù)時(shí)的啟動(dòng)因子，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的分化從而促進(jìn)軟骨及骨的形成

3、。 分子創(chuàng)傷學(xué)的發(fā)展使采用外源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子加速骨折愈合成為可能。但目前有關(guān)采用細(xì)胞生長(zhǎng)因子加速頜骨骨折愈合的研究結(jié)果都存在著一定的缺陷，表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)因子一方面生物活性大，生理作用強(qiáng)。另一方面體內(nèi)半衰期短，清除率高，非注射給藥生物利用度低，不能持續(xù)有效的促進(jìn)骨折愈合。為此一些學(xué)者采用骨折局部注射BMP一2和bFGF，或者研制多種緩釋bFGF和BMP-2載體材料等方法試圖解決這一難題，但都存在bFGF和BMP-2降解快，效果短暫

4、，操作復(fù)雜，不能穩(wěn)定而持久地發(fā)揮作用等情況。 納米技術(shù)是一門在納米級(jí)的尺度下，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行制備和工業(yè)化，并相互交叉發(fā)展的綜合性的科技體系。納米微球被器官或組織吸收，能顯著延長(zhǎng)藥效、提高利用度。通過(guò)對(duì)包裹材料的調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)納米微球在體內(nèi)的緩釋和靶向分布。 基于以上分析，結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，本課題通過(guò)藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)，采用聚乳酸(polylactic acid，PLA)為包裹材料，制備bFGF- PLA納米微球(bFGF-PLA-

5、Ns)、rhBMP-2-PLA納米微球(rhBMP-2-PLA-Ns)，探討bFGF和BMP-2緩釋系統(tǒng)加速頜骨骨折愈合的方法。我們將bFGF-PLA-Ns，rhBMP-2-PLA-Ns膠體液分別制成凍干粉劑和凝膠，研究微球藥物形態(tài)和粒經(jīng)分布；載藥量和包封率；體外緩釋時(shí)間、緩釋方程和生物學(xué)特性等。通過(guò)原代培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞，探討bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。觀察不同濃度bFGF-PLA-Ns和r

6、hBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響；對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的作用；對(duì)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和對(duì)礦化度的影響；在rhBMP-2-PLA-Ns干預(yù)下，探討成骨細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。建立兔下頜骨骨折模型，分別通過(guò)HE染色

7、，免疫組化研究PCNA和Ⅷ因子相關(guān)抗原的變化，四環(huán)素?zé)晒馊旧鹿堑纳?，原位雜交研究rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)VEGF的作用等方法，探討bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)兔下頜骨骨折愈合的作用。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果： 1、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的制備和其物理、化學(xué)特性： PLA納米微球制備：Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定三組PLA膠體平均粒徑分別為161nm

8、，154nm，160nm，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)bFGF和rhBMP-2進(jìn)行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中穩(wěn)定性測(cè)定，證實(shí)bFGF和rhBMP-2精密度和穩(wěn)定性可靠。采用復(fù)乳-干燥法(w/o/w)將bFGF和rhBMP-2制備成bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns，通過(guò)電鏡和Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定，顯示微球的粒莖為30～50nm，該納米微球表面光滑圓整，球體大小均勻，粒徑分布范圍窄。通過(guò)處方優(yōu)化采用1％乳糖作為支

9、架劑，載藥量和包封率研究證實(shí)bFGF-PLA-Ns包封率和載藥量分別為91.72±1.31％和[(27.65±0.44)×10<'-3>]％，rhBMP-2-PLA-Ns包封率和載藥量分別為90.54±1.32％和[(124.73±0.41)×10<'-3>]％。模擬體內(nèi)環(huán)境研究表明，bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns在14d內(nèi)，不僅一直持續(xù)釋放bFGF和rhBMP-2，而且所釋放出的bFGF和rhBMP-2濃度可以保

10、持在一定的水平。平均濃度分別是bFGF-PLA-Ns為(72.47±6.26)ng/ml，rhBMP-2-PLA-Ns為(73.44±5.38)ng/ml。以累積釋放率和時(shí)間進(jìn)行擬合，bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的體外釋藥規(guī)律均符合Higuichi方程，分別為：Q=27.7636 t<'1/2>-13.4247，r=0 9975，Q=26.7687 t<'1/2>-12.3283，r=0 9962。 2、

11、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞體外生物學(xué)效應(yīng)研究： 兔成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)并進(jìn)行形態(tài)觀察和鑒定。觀察bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞的增殖效應(yīng)(MTT法)。結(jié)果提示，bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns微球均能顯著的增加成骨細(xì)胞的增殖(p<0.05)。茜素紅染色研究表明，bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns都對(duì)礦化結(jié)節(jié)的形成有顯著的刺激作用

12、(p<0.05)。通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的研究，證實(shí)bFGF-PLA-Ns能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化(p<0.05)。免疫組化研究bFGF-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)影響，結(jié)果表明bFGF-PLA-Ns能增強(qiáng)PCNA活性(p<0.05)；免疫熒光研究rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞PCNA表達(dá)影響，表明rhBMP-2-PLA-Ns能增強(qiáng)PCNA活性。Western blot研究rhBMP-2-PLA-N

13、s對(duì)成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果表明rhBMP-2-PLA-Ns可以刺激成骨細(xì)胞自分泌VEGF的增加。 3、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns促進(jìn)下頜骨骨折愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： 建立兔下頜骨骨折模型，實(shí)驗(yàn)分為5組，設(shè)立空白組，單純bFGF組，bFGF-PLA-Ns凝膠試驗(yàn)組，單純r(jià)hBMP-2組和rhBMP-2-PLA-Ns凝膠試驗(yàn)組。分別在術(shù)后1周，2周，4周，8周處死動(dòng)物。 對(duì)骨折斷段病理切

14、片行HE染色觀察。結(jié)果提示：與空白組和對(duì)照組相比，試驗(yàn)組術(shù)后1周有新生骨小梁形成；術(shù)后2周有較多編織骨形成，成熟度高；術(shù)后4周編織骨進(jìn)一步增多、成熟、融合，可見(jiàn)大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成，骨痂比例明顯高于空白組和對(duì)照組。 原位雜交檢測(cè)VEGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)證實(shí)，rhBMP-2-PLA-Ns實(shí)驗(yàn)組要高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)。 骨折斷段病理切片PCNA免疫組化研究結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、空白組相比，在1、

15、2周PCNA陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.05)。 病理切片血管內(nèi)皮細(xì)胞行Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化研究表明，bFGF-PLA-Ns能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的高表達(dá)。 四環(huán)素?zé)晒庾C實(shí)bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns實(shí)驗(yàn)組均可以加快新骨的形成，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、以PLA為載體，采用復(fù)乳-干燥法(w/o/w)制備的bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns達(dá)到納米微球的各

16、項(xiàng)要求，各項(xiàng)組成無(wú)免疫原性，具備良好的生物安全性。 2、實(shí)驗(yàn)采用的微球制備方法和工藝確實(shí)可行。通過(guò)中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等專利檢索，“堿性成纖維生長(zhǎng)因子聚乳酸緩釋納米微球凝膠及其制備方法”具有原創(chuàng)性，已經(jīng)申請(qǐng)中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局技術(shù)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枺?00610095316.9)。 3、體外研究表明bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)兔成骨細(xì)胞具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)。 4、bFGF-PLA-Ns和rh