盾葉薯蕷三倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及植株再生.pdf

1、盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)為薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞草質(zhì)藤本植物，別名黃姜，火頭根。其根莖中富含的薯蕷皂苷元是合成甾體類激素和避孕藥的主要原料，因人工難以合成，被人們稱為“藥用黃金”。本研究室利用組織培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)胚乳培養(yǎng)獲得了盾葉薯蕷三倍體試管苗，在此基礎(chǔ)上，本文研究了盾葉薯蕷三倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其植株再生過程，以期建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與高頻率植株再生技術(shù)體系，為利用盾葉薯蕷細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生

2、產(chǎn)薯蕷皂苷元奠定技術(shù)基礎(chǔ)。本實驗的結(jié)果如下:
　　1.愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代。三倍體盾葉薯蕷莖段愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基是MS+2，4-D1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1，其誘導(dǎo)率達(dá)80.56％。經(jīng)3～5代后，根據(jù)其顏色特征和質(zhì)地，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種類型。
　　2.三倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及其生理生化特性的研究。選擇顏色質(zhì)地較好的Ⅰ型愈傷組織建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，細(xì)胞生長曲線呈“S”型，分為延遲期(0～

3、3d)，對數(shù)期(3～12d)，靜止期(12～15d)。細(xì)胞活力，可溶性蛋白質(zhì)含量，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且均在第6天達(dá)到最大值;細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值先下降后趨于平緩，維持在4.8～7.0之間;培養(yǎng)液的電導(dǎo)率在12天時降至最低點，進(jìn)入靜期后，培養(yǎng)液的相對電導(dǎo)率開始回升，后漸趨于平緩;培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中磷酸鹽、硝酸鹽、銨鹽濃度分別為118.75mg·L-1、2.44×103mg·L-1、3.71×102mg·L-1，培養(yǎng)結(jié)束時，培養(yǎng)液中

4、分別有9.26％、20.47％、6.13％的磷酸鹽、硝酸鹽、銨鹽剩余;延遲期，細(xì)胞培養(yǎng)物中皂苷元合成速度較慢，3天后皂苷元迅速合成，9天時皂苷元含量達(dá)到最大，為0.58％，之后皂苷元含量下降，進(jìn)入靜止期后，皂苷元含量維持在0.41％左右。
　　3.三倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化。盾葉薯蕷三倍體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)保持良好的生長狀態(tài)和皂苷元合成能力的適宜條件是:以3/4MS+NAA1.0mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1為培養(yǎng)基，4.5

5、g·L-1(DW)的接種量，12天的繼代周期，30g·L-1蔗糖作為碳源，pH值調(diào)至6.0左右。此外，研究了酵母、Cu2+誘導(dǎo)子及前提物質(zhì)乙酸鈉對細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的影響。當(dāng)酵母誘導(dǎo)子濃度為2.5％(v/v)時，細(xì)胞干重及皂苷元含量最高，分別為18.77g·L-1和0.81％;當(dāng)乙酸鈉濃度為0.5mg·L-1時，細(xì)胞的干重和皂苷元含量最大，分別為15.00g·L-1和0.79％。相對于對照，添加不同濃度的Cu2+對盾葉薯蕷三倍體細(xì)胞的生長