豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制子的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員。根據(jù)致病性、抗原性及核苷酸序列不同可將豬圓環(huán)病毒分為兩個(gè)型:豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。一般認(rèn)為PCV1沒(méi)有致病性，而PCV2則可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭癥(PMWS)、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎，豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)以及豬的先天性震顫(CT)等疾病。該病毒在全球各地廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)

2、損失。
　　 目前，豬圓環(huán)病毒病(PCVD)尚無(wú)有效的治療方法，主要是以疫苗預(yù)防為主。由于PCV2在細(xì)胞上增殖滴度低、體外培養(yǎng)困難，而且病毒復(fù)制機(jī)理尚不清楚，這給PCVD的防治帶來(lái)了很大的障礙。
　　 本研究共構(gòu)建了四個(gè)含有EGFP或Rluc報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子及三個(gè)非復(fù)制子對(duì)照。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究構(gòu)建的基于Rluc報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子具有較好的活性。該復(fù)制子既可為體外進(jìn)一步研究PCV復(fù)制機(jī)制奠定基礎(chǔ)，又可為抗病

3、毒先導(dǎo)化合物的篩選提供新方法。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)基于EGFP、Rluc報(bào)告基因標(biāo)記的PCV2復(fù)制子的構(gòu)建
　　 通過(guò)PCR方法，從含有PCV2全基因組的質(zhì)粒pT-PCV2上擴(kuò)增ORF1基因片段，然后將其插入到pIRES2-EGFP或pc-Rluc中，得到質(zhì)粒pIRES2-ORF1-EGFP和pc-Rluc-2A-ORF1。用帶有PCV2復(fù)制起始區(qū)(Ori)的引物，擴(kuò)增上述質(zhì)粒中CMV-polyA片

4、段，并連接至pMD18-T上，構(gòu)建了PCV2復(fù)制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP、pT-Ori-Rluc-2A-ORF1質(zhì)粒。同時(shí)，構(gòu)建了不帶Ori的非復(fù)制子對(duì)照pT-ORF1-IRES-EGFP和pT-Rluc-2A-ORF1。
　　 (2) PCV2復(fù)制子的優(yōu)化
　　 將構(gòu)建好的復(fù)制子轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP與其非復(fù)制子pT-OR

5、F1-IRES-EGFP的EGFP表達(dá)水平相當(dāng)，復(fù)制活性較弱;復(fù)制子pT-Ori-Rluc-2A-ORF1與非復(fù)制子pT-Rluc-2A-ORF1的Rluc表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pcDNA3.1(+)上直接表達(dá)Rluc，因此也不是理想的PCV2復(fù)制子。故對(duì)復(fù)制子進(jìn)行了優(yōu)化，將Ori插入到質(zhì)粒pc-Rluc-2A-ORF1中，得到了復(fù)制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori。將優(yōu)化的復(fù)制子轉(zhuǎn)染293T細(xì)

6、胞，發(fā)現(xiàn)復(fù)制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的Rluc表達(dá)水平顯著高于非復(fù)制子對(duì)照pc-Rluc-2A-ORF1，且pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的Rluc表達(dá)水平更高。將一定劑量復(fù)制子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h收取細(xì)胞樣品并提取細(xì)胞內(nèi)的總DNA，然后用特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR以檢測(cè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)顯著高于非復(fù)制子的拷貝數(shù)，且pc-Rluc-2A-O

7、RF1-Ori的拷貝數(shù)最高，是比較理想的PCV2復(fù)制子。
　　 (3) PCV2復(fù)制子活性檢測(cè)條件的優(yōu)化
　　 為了確定最佳收樣時(shí)間和最佳轉(zhuǎn)染劑量，首先轉(zhuǎn)染一定量的質(zhì)粒到293T細(xì)胞中分別于36h、42h、48h收取細(xì)胞樣品進(jìn)行海腎熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，熒光值也隨之增加，48h的熒光值最高，各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)復(fù)制子與非復(fù)制子對(duì)照的熒光值都呈顯著差異，綜合分析最終確定轉(zhuǎn)染后48h為最佳收樣時(shí)間。然后轉(zhuǎn)染不同

8、劑量的質(zhì)粒（1011、1010、109個(gè)拷貝數(shù)）到293T細(xì)胞中，于48h收取細(xì)胞樣品進(jìn)行海腎熒光素酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染同一劑量的復(fù)制子與非復(fù)制子的熒光值呈顯著差異。由于轉(zhuǎn)染1011個(gè)拷貝數(shù)質(zhì)粒的熒光值最高值為2.1×107，而再增加轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量，該值也不會(huì)增加;而轉(zhuǎn)染109個(gè)拷貝數(shù)質(zhì)粒的熒光值波動(dòng)較大，易受其他條件影響，最終確定1010個(gè)拷貝數(shù)為最佳轉(zhuǎn)染劑量。
　　 (4)基于PCV2復(fù)制子藥物篩選方法的建立
　　

9、 用已優(yōu)化好的條件，將復(fù)制子轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，4h后加入終濃度為100μM的利巴韋林。然后于48h收取細(xì)胞樣品進(jìn)行海腎熒光素酶活性檢測(cè)。加入利巴韋林試驗(yàn)組與未加利巴韋林試驗(yàn)組相比較，復(fù)制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的熒光值分別降低27.9％和16.7％，而非復(fù)制子質(zhì)粒的熒光值無(wú)顯著差異。
　　 將一定劑量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，4h后加入終濃度為100μM的利巴韋林。于48h收取