一種與聚羥基脂肪酸酯生物合成相關(guān)的新型水合酶結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、辣椒疫霉是一種世界性土傳病害，辣椒疫病嚴(yán)重影響世界各國(guó)的辣椒生產(chǎn)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病寄主范圍廣，可以侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、茄子、番茄等20多種作物。近年來(lái)有關(guān)其發(fā)病機(jī)制、致病機(jī)理、防治策略等相關(guān)報(bào)道層出不窮，而從類(lèi)似的致病菌中尋找有益基因?yàn)槿祟?lèi)所利用卻鮮有報(bào)道。
　　2008年辣椒疫霉全基因組序列草圖由美國(guó)能源部基因研究所公布于眾（網(wǎng)址http://genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.h

2、ome.html）并不斷更新完善。通過(guò)生物信息學(xué)分析，越來(lái)越多的人們感興趣的基因得以被發(fā)現(xiàn)進(jìn)而為揭示其相關(guān)功能并被人們所利用提供了便利。我們研究的類(lèi)單胺氧化酶C類(lèi)水合酶(MaoC-like hydratase，MaoC)即是在對(duì)其全基因組序列分析的基礎(chǔ)上獲得的一個(gè)新基因。MaoC在連接脂肪酸的β-氧化到聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)的生物合成過(guò)程中具有加水作用，是最近被發(fā)現(xiàn)的一種新型R型水合酶。

3、>　　全球化的環(huán)境問(wèn)題使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注于可生物降解材料的開(kāi)發(fā)與使用。在被研究中的可生物降解材料中，PHA以其所具有的生物降解性、生物相容性、熱塑性和機(jī)械性能成為一種理想的“綠色塑料”替代物。所以，許多科學(xué)家正在嘗試研制低成本高產(chǎn)出的PHA生產(chǎn)方案。PHA生產(chǎn)成本的降低可以使其成為那些在自然壞境中很難分解的傳統(tǒng)塑料的理想替代物，即作為“綠色塑料”被使用。MaoC即是首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)的一種新型R型水合酶，它在脂肪酸的β-氧化到PHA

4、的生物合成過(guò)程中起重要作用:MaoC作為R型水合酶的新成員可以提供PHA合成的前體物質(zhì)，R-3-酮?；o酶A。
　　我們?cè)诶苯芬呙咕锌寺〉搅艘粋€(gè)新MaoC基因，獲得了其蛋白晶體并解析了其高分辨率三維結(jié)構(gòu)，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)對(duì)其功能進(jìn)行了深入研究。具體總結(jié)如下:
　　1.在致病菌辣椒疫霉中克隆到一個(gè)有益基因MaoC，對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)出的重組蛋白利用親和層析、陰離子柱交換層析、分子排阻層析等手段進(jìn)行了純化，得到了具有較高

5、純度的穩(wěn)定重組蛋白;利用特異性的酶活實(shí)驗(yàn)以巴豆酰輔酶A為底物對(duì)重組純蛋白進(jìn)行了酶活測(cè)定，結(jié)果顯示重組純蛋白具有乙酰輔酶A水合酶活性，達(dá)到58.1U/mg，MaoC因其乙酰輔酶A水合酶活性而成為與PHA合成相關(guān)的眾多酶類(lèi)的一員，是一種新型的R型水合酶，為PHA的合成提供前體物質(zhì)，R-3-酮酰基輔酶A;
　　2.采用氣相擴(kuò)散懸滴結(jié)晶法獲得了MaoC高質(zhì)量蛋白晶體，并用分子置換法解析出分辨率達(dá)1.93(A)的晶體結(jié)構(gòu);對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了

6、細(xì)致描述與分析:MaoC具有R型水合酶類(lèi)典型的結(jié)構(gòu)折疊，分為明顯的N-區(qū)域和C-區(qū)域，兩個(gè)區(qū)域間由一個(gè)鹽橋相連;具有典型的稱(chēng)為“熱狗折疊”的保守結(jié)構(gòu)域，并且N-區(qū)域不完整，而C-區(qū)域是完整的“熱狗折疊”;MaoC通過(guò)四個(gè)α螺旋相互作用形成了同源二聚體結(jié)構(gòu)，且參與二聚化作用的氨基酸在R型水合酶中是高度保守的;結(jié)構(gòu)上的精細(xì)分析與比對(duì)還發(fā)現(xiàn)MaoC存在一段潛在的活性抑制片段;
　　3.以序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)為基礎(chǔ)，確定了MaoC的催化中心為以

7、下三個(gè)氨基酸:D194、H199和G217。為了驗(yàn)證其催化作用我們做了三個(gè)定點(diǎn)突變:D194E、H199Q和G217A;對(duì)三個(gè)突變體重組蛋白進(jìn)行了純化，并對(duì)純蛋白進(jìn)行了圓二色性、蛋白雜交和分子排阻層析驗(yàn)證，以確定其分子量及蛋白的真實(shí)性等;酶活測(cè)定結(jié)果顯示三個(gè)氨基酸中D194和H199對(duì)MaoC行使酶活性起重要作用，G217起次要作用，具體作用方式為:D194通過(guò)吸引催化水分子上的一個(gè)質(zhì)子而激活水分子，活化了的水分子攻擊底物巴豆酰輔酶A上

8、的碳原子，同時(shí)H199對(duì)底物上的碳原子貢獻(xiàn)一個(gè)質(zhì)子以使反應(yīng)順利進(jìn)行，而G217通過(guò)氫鍵作用與底物硫酯鍵上的碳?；Y(jié)合，起到穩(wěn)定底物的作用;
　　4.二聚體是MaoC的活性形式，MaoC通過(guò)四個(gè)α螺旋相互作用形成了同源二聚體結(jié)構(gòu)。通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，參與二聚化作用的氨基酸在不同的R型水合酶中是高度保守的，同時(shí)大部分已報(bào)道的R型水合酶結(jié)構(gòu)均為二聚體結(jié)構(gòu)，并且與MaoC具有類(lèi)似的作用方式?；诮Y(jié)構(gòu)上的分析與比對(duì)，我們推測(cè)二聚化作

9、用對(duì)MaoC行使酶活性是必須的。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們做了三個(gè)定點(diǎn)突變:R23D，M27E和L191D;對(duì)三個(gè)突變體純蛋白進(jìn)行分子排阻層析驗(yàn)證表明三個(gè)突變體均成功破壞了MaoC的二聚化作用，成為單體蛋白;酶活測(cè)定結(jié)果顯示三個(gè)突變體單體蛋白均喪失活性，證實(shí)二聚化作用對(duì)MaoC行使酶活性是必須的;本研究首次通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)二聚化作用對(duì)MaoC酶活起關(guān)鍵作用，考慮到二聚化作用在R型水合酶類(lèi)蛋白上的普遍存在性，我們的結(jié)論即二聚化作用對(duì)其行使正常

10、酶活是必須的可能對(duì)此類(lèi)蛋白具有普遍適用性;一個(gè)單體結(jié)構(gòu)可能會(huì)更好的解釋其機(jī)制，然而我們對(duì)MaoC單體蛋白的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)未能成功;
　　5.以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)我們對(duì)MaoC進(jìn)行了酶工程改造，以期得到與野生型蛋白相比具有較高酶活的突變體。結(jié)構(gòu)分析表明一段非保守的插入片段可能對(duì)MaoC的酶活調(diào)節(jié)起作用。如果我們的假設(shè)正確的話(huà)，刪除此片段將會(huì)對(duì)MaoC的活性產(chǎn)生影響。基于此假設(shè)我們對(duì)此區(qū)域進(jìn)行了定點(diǎn)突變與片段刪除突變，并對(duì)純化后的突變體重組蛋白進(jìn)行

11、了酶活測(cè)定，結(jié)果顯示兩個(gè)突變體分別有較大幅度的活性提高:突變體De163-71酶活為91.2U/mg，約為野生型蛋白的1.5倍;突變體De163-88酶活為126.7U/mg，約為野生型蛋白的兩倍;而定點(diǎn)突變對(duì)MaoC酶活基本無(wú)影響;分子排阻層析實(shí)驗(yàn)表明突變體活性的增強(qiáng)與其聚合狀態(tài)無(wú)關(guān)，因?yàn)閮蓚€(gè)活性增強(qiáng)突變體均為二聚體;我們的研究表明MaoC上非保守的插入片段對(duì)其活性有抑制作用。
　　隨著世界環(huán)境問(wèn)題變得越來(lái)越嚴(yán)峻，發(fā)展綠色環(huán)保塑