基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的茶樹(shù)DNA分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究.pdf

1、茶樹(shù)(Camellia sinensis)是遺傳研究和基因組信息比較缺乏的物種。目前,茶樹(shù)上可有效利用的標(biāo)記數(shù)量非常有限。本研究不僅以現(xiàn)有的公共EST數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行茶樹(shù)SSR和SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究,而且通過(guò)高通量RNA—seq獲得大量茶樹(shù)花的轉(zhuǎn)錄組序列,并以這轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)進(jìn)行茶樹(shù)SSR分子標(biāo)記的大規(guī)模發(fā)掘,主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)對(duì)NCBI網(wǎng)上公開(kāi)的12,757條茶樹(shù)ESTs序列進(jìn)行聚類(lèi),成功構(gòu)建了茶樹(shù)的獨(dú)立

2、基因(Unigene)數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)的EST序列冗余率約為68.2％,明確了茶樹(shù)EST—SSRs的分布特征,設(shè)計(jì)了206對(duì)SSR引物,篩選出多態(tài)性SSR引物59對(duì)。
　　 (2)利用開(kāi)發(fā)的SSR引物對(duì)茶樹(shù)地方品種的遺傳多樣性取樣策略和西湖龍井群體的遺傳分化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)平均等位位點(diǎn)Na是最合適的遺傳多樣性取樣參數(shù),當(dāng)用平均等位位點(diǎn)Na做參數(shù),SSR引物等位位點(diǎn)數(shù)為5時(shí),24個(gè)以上單株才能達(dá)到總體90％以上的遺傳變異:龍井群體

3、具有較高的遺傳多樣性水平,平均多態(tài)信息含量PIC為0.4382,中度多態(tài)位點(diǎn)占62.5％,高度多態(tài)位點(diǎn)占33.3％。哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)表明,66.7％的SSR位點(diǎn)不符合哈迪-溫伯格平衡。分子方差分析表明,西湖龍井五個(gè)居群間的遺傳分化程度較低。
　　 (3)初步建立了茶樹(shù)EST-SNP開(kāi)發(fā)體系,明確了茶樹(shù)EST中SNP的分布規(guī)律,茶樹(shù)編碼區(qū)的SNP發(fā)生頻率約為0.58％,平均200bp就有一個(gè)SNP位點(diǎn),并進(jìn)一步推算出茶樹(shù)基因組

4、DNA序列的雜合率約為0.38％,平均300個(gè)堿基就可能出現(xiàn)一個(gè)雜合位點(diǎn)。從237個(gè)多基因聚類(lèi)簇中發(fā)現(xiàn)了818個(gè)SNP候選位點(diǎn),設(shè)計(jì)了25對(duì)SNP引物進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)EST—SNP候選位點(diǎn)的多態(tài)檢出率為75％。
　　 (4)應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)茶樹(shù)花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得茶樹(shù)花的轉(zhuǎn)錄組信息75,331條,平均序列長(zhǎng)度為402bp,平均測(cè)序深度為23.45,平均測(cè)序覆蓋度為0.895。通過(guò)基因表達(dá)水平RPKM值分布分析

5、,發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)花的轉(zhuǎn)錄組以中低表達(dá)豐度的基因?yàn)橹?。?jīng)過(guò)和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss—Prot、KEGG和COG四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),共有50,975條茶樹(shù)花轉(zhuǎn)錄組的unigene被注釋。
　　 (5)對(duì)茶樹(shù)花轉(zhuǎn)錄組表達(dá)信息進(jìn)行大通量SSR位點(diǎn)的發(fā)掘,發(fā)現(xiàn)了含SSRs的序列10,290條,共12,582個(gè)SSRs,茶樹(shù)花轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)的頻率為16.66％。茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了340種堿基重復(fù)模式,在茶樹(shù)花的轉(zhuǎn)錄組序列中共發(fā)現(xiàn)340種堿基重復(fù)