香蕉est-ssrs標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

1、HEREDITAS(Beijing)2008年7月30(7):933―940ISSN02539772研究報告收稿日期:2007?09?25修回日期:2008?04?08基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號：30460070)、海南省自然科學(xué)基金(編號：80436)、科技部科技基礎(chǔ)條件平臺(編號：2005DKA210005001)和農(nóng)業(yè)部南亞熱作專項(xiàng)(2007)資助[SupptedbytheNationalNaturalScienceFoun

2、dationofChina(No.30460070)NaturalScienceFoundationofHainanProvince(No.80436)theNationalFacilitiesInfmationInfrastructurefScienceTechnology(No.2005DKA210005001)MinistryofAgriculturalSpecialFoundationofSouthAsiafTropicalPl

3、ant(2007)]作者簡介:王靜毅(1978?)女博士研究生研究方向：植物分子遺傳學(xué)。Email:kiwi998@通訊作者:武耀廷(1962?)男博士研究員研究方向：植物分子遺傳學(xué)。Email:wuyaoting@tsinghua.DOI:10.3724SP.J.1005.2008.00933香蕉ESTSSRs標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用王靜毅1陳業(yè)淵2劉偉良1武耀廷31.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)研究所?？?711012.中國熱帶農(nóng)業(yè)科

4、學(xué)院熱帶作物品種資源研究所儋州5717373.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院熱帶園藝植物資源與遺傳改良教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海口570228摘要：從NCBI搜索的2282條香蕉EST中發(fā)掘出含有SSR的EST序列110條共有122個SSR位點(diǎn)檢出率為5.3%。SSR位點(diǎn)可分為37種重復(fù)單元平均長度為20bp其中二、三核苷酸重復(fù)單元的SSR占主導(dǎo)地位分別占總SSR的33.1%和47.6%。GA和GAA是二、三核苷酸中的優(yōu)勢重復(fù)類型分別占二、三核苷酸重復(fù)類型的7

5、5.7%和36.0%其他重復(fù)類型所占比例均不足10%而四核苷酸重復(fù)類型最少為4.0%。設(shè)計(jì)的63對ESTSSRs引物中有41對ESTSSRs引物對巴西蕉基因組DNA能擴(kuò)增出產(chǎn)物占總引物數(shù)的65.1%。應(yīng)用進(jìn)一步篩選出的重復(fù)性好、多態(tài)性高的19對引物對49個香蕉品種(系)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每對引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶數(shù)目為4~12個平均7.58個引物多態(tài)信息量變化范圍為0.3572~0.8744平均0.7324。在相似系數(shù)為0.63的水平可將49

6、個品種聚為2個類群：一類為含B基因組香蕉品種另一類為不含B基因組的香蕉品種表明ESTSSR引物可以應(yīng)用于香蕉品種資源分類的研究。關(guān)鍵詞：香蕉ESTESTSSR遺傳多樣性聚類分析DevelopmentapplicationofESTderivedSSRmarkersfbananas(MusananaLour.)WANGJingYi1CHENYeYuan2LIUWeiLiang1WUYaoTing31.InstituteofTropical

7、BioscienceBiotechnologyChineseAcademyofTropicalAgricultureSciences(CATAS)Haikou571101China2.InstituteofTropicalCropsGeicResourcesCATASDanzhou571737China3.MinistryofEducationKeyLabatyofTropicalHticulturePlantResourcesPCR產(chǎn)

8、物大小為90～350bp引物復(fù)性溫度為45～60℃(GC)含量為40%～70%最適為50%。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。1.3DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μL含有2μL的10PCRbuffer、0.25μL的10mmolLdNTP、0.15μL的TaqDNA聚合酶(5UμL)、2.5μmolL的正反引物各1μL和20ng模板DNA。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min94℃變性20s55℃復(fù)性

9、30s72℃延伸45s35個循環(huán)72℃延伸7min。采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。DNA提取和銀染的方法參照文獻(xiàn)[14]。1.4統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)條帶時有帶用“1”表示、無帶用“0”表示、缺失用“9”表示。采用Nei的方法計(jì)算相似系數(shù)：GS=2Nij(NiNj)當(dāng)中的Ni、Nj、Nij分別表示第i個材料擴(kuò)增帶數(shù)、第j個材料的擴(kuò)增帶數(shù)、第i和第j個材料擴(kuò)增的共有帶數(shù)[15]。計(jì)算多態(tài)信息量(Polymphisminfmat

10、ioncontentPIC)為PIC=1?Σpi2其中pi表示第i個條帶的頻率[16]。用UPGMA(Unweightpairgroupmethodwitharithemeticaverages)方法應(yīng)用NTSYSpc2.10軟件[17]進(jìn)行聚類分析繪制樹狀圖。2結(jié)果與分析2.1香蕉ESTSSR的開發(fā)在搜索的總長為1322.716kb的2282條香蕉EST序列中共檢測出分布于110條EST中的122個SSR占全部EST的4.8%出現(xiàn)頻率

11、為5.3%其中含1個SSR的序列有99條含2個SSR的序列有10條含3個SSR的序列有1條。SSR長度在15～36bp之間平均長度為20bp。在所檢測含有SSR的EST序列中二核苷酸重復(fù)單元的有37條占所檢出總數(shù)的33.6%含三核苷酸重復(fù)單元的有49條占所檢出總數(shù)的45.5%(表2)這兩種核苷酸重復(fù)單元占多數(shù)合計(jì)占所有檢出總數(shù)的79.1%。四、五、六核苷酸的SSR數(shù)量較少三者共占所有檢出總數(shù)的20.9%。在含有二核苷酸重復(fù)單元的香蕉ES

12、T序列中GATC重復(fù)單元最多約占75.5%三核苷酸重復(fù)單元的香蕉EST序列中以AAGCTT重復(fù)單元最多其次是GCACGT、CCTGGA和CCGGGC(表3)。表2SSRESTs序列中不同重復(fù)核苷酸數(shù)的數(shù)量及百分比Table2NumberfrequencyofrepeattypesinSSRESTs重復(fù)核苷酸數(shù)NumberofrepeatsSSRESTs數(shù)量(條)NumberofSSRESTs占所有SSRESTs的百分比%ofSSREST

13、swithSSRsSSR數(shù)目NumberofSSR占全部SSR比例ProptioninallSSRs(%)出現(xiàn)頻率Frequency平均分布頻率Averagedistance(1kb)二核苷酸Dinucleotide3733.64133.61.832.26三核苷酸Trinucleotide4945.55746.72.522.42四核苷酸Tetranucleotide54.554.10.2264.54五核苷酸Pentanucleotide