小麥籽粒脂肪氧化酶活性功能標記的開發(fā)與應用.pdf

1、脂肪氧化酶(LOX)是影響小麥籽粒和面粉儲藏特性的主要因素之一,通過降低小麥籽粒中的LOX活性可以有效地延長其儲藏時間。目前主要采用生化檢測的方法來測定小麥籽粒中的LOX活性,但此方法成本較高,完成一次檢測的時間較長且選擇效率低,不能檢測育種早代材料中的LOX活性,因此本文試圖通過研究小麥LOX基因遺傳變異的規(guī)律,開發(fā)出小麥籽粒LOX活性的分子標記,來改良LOX活性。本試驗對已公布的LOX基因序列進行了搜索和比對并設計引物,研究小麥籽粒

2、LOX活性的功能標記,并用該標記分析了203份小麥品種(系)基因型與表型之間的關系。主要結果如下:
　　1、根據(jù)NCBI網站上已公布的小麥LOX基因(GenBankGU167920.1)序列,在不同位置設計了多對引物,以LOX活性差異較大的兩組材料基因組DNA為模板進行PCR擴增,結果發(fā)現(xiàn)其中一對引物(LOX1-wp01)在高、低LOX活性材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。引物LOX1-wp01擴增產物的電泳帶型在兩組材料間存在明顯差異,其在高

3、LOX活性的材料中均擴增出a、b、c三條帶,在低LOX活性的材料中均擴增出a、c兩條帶。利用該標記檢測203份小麥品種,結果表明有164個品種可以擴增出a、b、c三條帶,占總樣本量的80.79％,其LOX活性平均值為10.46nkat/g;39個品種擴增出a、c兩條帶,占總樣本量的19.21%,LOX活性平均值為7.36nkat/g,方差分析表明兩者的差異達極顯著水平(P<0.01)。因此,認為LOX1-wp01可以在小麥LOX活性分子

4、標記輔助選擇中加以應用。
　　2、利用LOX1-wp01對203份小麥品種(系)的基因型進行檢測,分別篩選到鶴麥026、內白、W1032、鄭麥9405、魯麥22、安農糯1、ZWY-10、周麥16、皖協(xié)497、煙農21等10份高LOX活性品種(系),LOX活性在14.65nkat·g-1~19.43nkat·g-1之間;周麥11、蒿優(yōu)9409、淮麥19、內鄉(xiāng)188、P206、陜228、揚輻麥5242、皖0606、安農95081-8、

5、皖0202等10份低LOX活性品種(系),LOX活性在4.56nkat·g-1~5.93nkat·g-1之間。這些資源材料對于針對小麥LOX活性的品質改良研究具有一定的實際意義。
　　3、切取電泳條帶a、b、c回收、測序,經Blast分析發(fā)現(xiàn),a、b、c三條序列都與小麥LOX1基因存在高度同源性,a序列與硬粒小麥Lpx-B1.2(HM126467.1)基因序列重合區(qū)域為99%,相似率達100%;b序列與硬粒小麥Lpx-B1.1(H

6、M126468.1)基因序列重合區(qū)域為100%,相似率達99%;c序列與硬粒小麥Lpx-B1.1(HM126468.1)基因序列重合區(qū)域為99%,相似率達96%。同時,a、b、c三條序列自身也存在高度同源。進一步分析發(fā)現(xiàn),在所擴增的基因序列片段中存在3個內含子,所有內含子都符合內含子的GT-AG法則,且3條序列的差異區(qū)段都分布在這3個內含子之間。因此,本研究認為在普通六倍體小麥中LOX1存在3個位點,分別指定序列a為LOX1.2(Gen

7、BankJQ715610),序列b為LOX1.1(GenBankJQ715609),序列c為LOX1.3(GenBankJQ715611)。
　　4、通過對NCBI上注冊的禾本科作物LOX基因序列的搜索與比對后發(fā)現(xiàn),禾本科作物的LOX基因大體聚為四類,第一類包括L37359.1、HQ913602.1和DQ474244.1,都為LOX3基因;第二類包括NM001112503.1、X64396.1、L37358等7條LOX2基因;第三

8、類包括HM126467.1、DQ474241.1、JQ715610等14條LOX1基因;第四類包括EU725461.1和AB099850.1兩條LOX1基因。從分類上看,LOX1基因被分為了兩類,即第三類和第四類,水稻屬的兩條LOX1基因(EU725461.1和AB099850.1)單獨被分為了一類,表明水稻屬LOX1基因的親緣關系與其他禾本科作物LOX1基因的親緣關系較遠。另外,對上述前三類進一步分析,認為小麥屬LOX基因與大麥屬LO

9、X基因的親緣關系最近。
　　5、根據(jù)同源性設計引物,采用RT-PCR技術,克隆到六倍體普通小麥LOX1基因cDNA片段,大小為384bp,推導氨基酸殘基為127個,分子量為11.15kD,等電點pI為4.93,與杜倫小麥、大麥、高粱、水稻的相似率分別為99.7%、94.8%、73.7%、56.2%,結果表明親緣關系相近的物種之間核苷酸序列差異小且遺傳距離也小,親緣關系較遠的物種之間核苷酸序列差異較大,遺傳距離較遠?？梢?物種之間的