酯酶與氧化酶

1、酯酶,Esterase,一、基本概念1. 定義：　酯酶(Esterase), 催化作用于酯類物質(zhì)的酯健,使之水解的酶的總稱,包括磷酸酶, 羧酸酯水解酶, 硫酸酯水解酶等。羧酸酯水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是所有能催化羧酸酯水解的酶的總稱（或稱酯酶），其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反應(yīng)式：,羧酸,2. 酯和酯鍵酯由來(lái)自羧酸的酰基和來(lái)自醇的烴氧基組成，是羧酸與醇反應(yīng)失水而生成，即羧基上羥基

2、和醇羥基上的氫共同脫水。通式R-CO-OR`，結(jié)構(gòu)上可看作羧酸中的羥基被烴氧基（-OR`）取代的產(chǎn)物，亦可看作醇中羥基的氫原子被?；≧-CO-）取代的產(chǎn)物。,羧酸,?；≧-CO-）是含氧酸分子（RCOOH）中去掉酸性O(shè)H后（即能離解出H+的OH基）余下的基團(tuán)。包括丙?；?丙酸）、苯甲?；ū郊姿幔⒉蒗；ú菟幔?、苯磺?；ū交撬幔?、亞硝?；▉喯跛幔?、亞硫?；▉喠蛩幔⒘柞；姿幔?3. 酯酶與水解反應(yīng)　 羧酸酯酶水解

3、羧酸酯為醇和羧酸　芳香酯酶水解乙酸苯酯為酚和乙酸　脂肪酶水解甘油三酯為甘油二酯和脂肪酸　乙酰酯酶水解乙酰酯為醇和乙酸　乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿為膽堿和乙酸　膽堿酯酶水解酯酰膽堿為膽堿和羧酸,根據(jù)酶對(duì)底物、pH、激活劑、抑制劑的反應(yīng)特點(diǎn)，可將酯酶分為20余種，在生物化學(xué)上統(tǒng)稱為酯酶，只有一部分可用組化的方法證明。通常根據(jù)對(duì)底物是否具有特異性，可分為特異性與非特異性酯酶兩種。分解短鏈（C2～C4）低級(jí)脂肪酸酯多為非特異性酯酶，如芳

4、香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特異性酯酶據(jù)其底物特異性可分為，分解長(zhǎng)鏈(C8以上）高級(jí)脂肪酸酯的酶稱酯酶(Lipase)，分解乙酰膽堿的乙酰膽堿酯酶，分解酯酰膽堿的膽堿酯酶。,二、酯酶的分類,（一）非特異性酯酶(non-specific esterase)： 無(wú)底物特異性。根據(jù)E600, DFP, PCMB對(duì)它們的抑制作用不同，分為3類.1. 芳香\基酯酶(Aromesterase)，即A-酯酶，亦稱有機(jī)磷酸抵抗性酯酶I。（１）

5、底物：　　　?－萘酚乙酯萘酚ＡＳ乙酸酯類吲哚酚乙酸酯類,（２）完全抑制①10mmol/L 磷酸二乙基對(duì)硝基苯酯(E 600)②1mmol/L CuSO4③1mmol/L Pb(NO3)2④10mmol/L AgNO3⑤100 ?mol/L 對(duì)氯高汞苯甲酸(PCMB)（３）激活１mmol/L　半胱氨酸(Cysteine),２、脂肪族酯酶（aliesterase),即B-酯酶，亦稱有機(jī)磷酸敏感性酯酶（１）底物

6、?－萘酚乙酯；萘酚ＡＳ乙酸酯類；吲哚酚乙酸酯類。（２）完全抑制10?mol/L　磷酸二乙基對(duì)硝基苯酯(E-600)100?mol/L　毒扁豆堿(Eserine)10mmol/L AgNO3,３.乙酰酯酶(acetylesterase)：即C-酯酶， 又稱有機(jī)磷酸抵抗性酯酶Ⅱ（１）底物吲哚酚乙酸酯類萘酚AS乙酸酯類（２）完全抑制10mmol/L ?-苯丙酸10mmol/L A

7、gNO31mmol/L CuSO4（３） 激活100?mol/L 對(duì)氯高汞苯甲酸(PCMB)100?mol/L 苯氯化汞,（二）特異性酯酶(Specific esterase)根據(jù)底物的特異性分為三種:１、脂酶(Lipase)底物：高級(jí)脂肪酸抑制劑：毒扁豆堿(eserine)激活劑：2.5%?；悄懰徕c２、膽堿酯酶(cholinesterase) 特異性底物：丁酰硫代膽堿

8、 抑制劑：四異丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA) 3、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase)　 底物：乙酰－?－甲基硫代膽堿　　　　 乙酰硫代膽堿　　　　 ３－乙?；担胚嶂氐}　 抑制劑：四異丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA),酯酶的鑒別１、根據(jù)底物特異性　　選擇特異底物配制孵育液２、選擇一定濃度的抑制劑或激活劑　　通常使用抑制劑的方法是向底物液中加抑制劑或?qū)⑶衅谝种埔褐?/p>

9、浸漬。,（一）顯示法 A.偶氮色素法 １、反應(yīng)原理　　在酶作用下，從底物游離出來(lái)的?-萘酚AS與重氮鹽偶聯(lián)形成偶氮色素，同時(shí)沉著于酶的存在部位，通過(guò)偶氮色素顯色，間接證明酶的存在部位?！　?-萘酚系統(tǒng)可用重氮鹽堅(jiān)牢藍(lán)Ｂ，堅(jiān)牢藍(lán)RR，堅(jiān)牢紅RC鹽?！　≥练覣S系統(tǒng)用柘榴石（黃色）、GB鹽、堅(jiān)牢紅RC、堅(jiān)牢紅紫LC鹽。,三、非特異性酯酶,2. 孵育液 （萘酚AS乙酸酯法 Pearse,1972）　1%萘酚AS醋酸鹽（丙

10、酮溶液）0.1ml (底物）　0.05mol/L PBS(pH 7.0) 10ml（緩沖液）　堅(jiān)牢藍(lán)B鹽30mg（重氮鹽）　攪拌過(guò)濾使用3. 操作步驟 (1)新鮮組織恒冷箱切片； (2)入孵液，室溫或37℃ 20-30min； (3)流水沖洗2min； (4)2%甲基綠復(fù)染細(xì)胞核； (5)流水沖洗3-5min； (6

11、)甘油明膠封固。,4. 結(jié)果與評(píng)價(jià)　　酶活性部位為黑色，胞核為綠色?；钚圆课坏娜旧曋氐}不同而異。堅(jiān)牢紅TR為紫紅色，堅(jiān)牢紅RC為暗紅色，堅(jiān)牢藍(lán)RR為青銅色。,5. 組織處理說(shuō)明　　非特異性酯酶類對(duì)固定的抵抗性較強(qiáng)，可用醛類固定液固定后冰凍切片。10%福爾馬林鈣、4%多聚甲醛－磷酸緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液，pH7.2-7.4; 4℃固定16-18小時(shí)，時(shí)間隨酶活性強(qiáng)弱不同。,?-醋酸萘酚酯 萘酚AS乙酸酯

12、 堅(jiān)牢藍(lán)B鹽 堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽,B.偶氮吲哚酚法1. 反應(yīng)原理　　在非特異性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯被水解為吲哚酚和醋酸，吲哚酚與六氮鹽偶聯(lián)成偶氮色素。,吲哚酚酯,吲哚酚,羧酸,+,六氮鹽 偶氮色素,,2. 孵育液　醋酸吲哚酚 3mg　二甲基甲酰胺 0.3ml　六氮化副薔薇苯胺緩沖液10ml　（六氮化副薔薇苯胺0.3ml溶

13、于0.1mol/L PBS [pH5-6],用1mol/L-0.1mol/L NaOH將pH調(diào)至5-5.5，混勻過(guò)濾立即使用。）,3. 操作步驟(1)恒冷箱切片入孵液，37℃15-60min；(2)蒸餾水洗；(3)4%甲醛固定數(shù)小時(shí)；(4)甘油明膠封固。,4. 結(jié)果酶活性處呈紅棕色,腹水癌細(xì)胞中的酯酶,巨噬細(xì)胞中的酯酶,C.吲哚酚法(靛藍(lán)法) Pearse, 1972 １.原理　醋酸吲哚酚經(jīng)酶水解釋放出吲哚酚，再氧

14、化形成靛藍(lán)沉著于酶所在部位。,底物:5-溴-6-氯吲哚酚乙酸酯,5-溴吲哚酚乙酸酯等.氧化劑:鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀,２.孵育液(1)醋酸溴吲哚酚酯2mg(2)二甲基甲酰胺0.2ml(3)儲(chǔ)備液10ml,儲(chǔ)備液配制：　①鐵氰化鉀(1.65%)5ml?、趤嗚F氰化鉀(2.11%)5ml　③0.1mol/L Tris-HCL緩沖液pH6.820ml　④2%CaCL210m

15、l　⑤蒸餾水10ml,3. 操作步驟新鮮組織恒冷箱切片；切片入孵育液，37℃或室溫 5-120min；蒸餾水洗；甘油明膠封固。4. 結(jié)果　酶活性部位呈青綠色，背底無(wú)色。５.注意鐵氰化鉀氧化吲哚酚除產(chǎn)生靛藍(lán)外，還有無(wú)色產(chǎn)物。因此酶活性與顯色無(wú)平行關(guān)系，可定性不可定量。,腎間質(zhì)細(xì)胞 油螺卵母細(xì)胞 底物：5-溴吲哚酚乙酸酯,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體，生理功能尚不清楚,目前認(rèn)

16、為主要參與酯類和蛋白質(zhì)代謝。極強(qiáng)陽(yáng)性：胰腺外分泌部腺細(xì)胞，橫紋肌運(yùn)動(dòng)終板，小腸 上皮細(xì)胞；強(qiáng)陽(yáng)性：肝細(xì)胞，腎近曲小管上皮，結(jié)腸上皮細(xì)胞；陽(yáng)性：胰腺和腮腺導(dǎo)管上皮，食管上皮，腸腺上皮，肺泡 巨噬細(xì)胞，睪丸間質(zhì)細(xì)胞。弱陽(yáng)性：心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞，膽管、甲狀腺、氣管、支 氣管、膀胱等上皮細(xì)胞。,（二）非特異性酯酶的生物學(xué)意義,廣義的膽堿酯酶包括乙酰膽堿酯酶（AChE)和狹義的膽堿酯酶(Ch

17、E)，兩者化學(xué)性質(zhì)不同，用酯來(lái)檢測(cè)底物特異性時(shí)，乙酰膽堿酯酶能最快地促使乙酰膽堿分解，也能水解乙酰-β-基甲基膽堿，但不能水解苯甲酰膽堿，此酶能被高濃度的乙酰膽堿抑制。但膽堿酯酶卻不同，乙酰膽堿濃度越高，越能被膽堿酯酶所分解。ChE還能水解苯甲酰膽堿，但不能水解乙酰-β-基甲基膽堿。,乙酰膽堿+H2O 膽堿+醋酸酯酰膽堿+H2O 膽堿+羧酸,,,,,AChE,ChE,四、乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶(Acetylch

18、olinesterase and Cholinestrase, AChE and ChE),AChE 和 ChE　的底物特異性,（一）顯示方法——亞鐵氰化銅法,1、反應(yīng)原理　　利用乙酰膽堿酯酶能將乙酰膽堿鹽水解產(chǎn)生硫代膽堿，使鐵氰化物還原為亞鐵氰化物，再與銅離子結(jié)合形成亞鐵氰化銅顯色沉淀，證明酶活性的存在。,乙酰膽堿鹽,,AChE,硫代膽堿,若用四異丙基焦磷酰胺抑制膽堿酯酶，可單獨(dú)顯示乙酰膽堿酯酶。,鐵氰化鉀,,,亞鐵氰化鉀+Cu2+

19、,,亞鐵氰化銅,,２、孵育液　乙酰硫代膽堿碘鹽5mg　0.1mol/L醋酸緩沖液pH5.56.5ml　0.1mol/L (2.94%) 檸檬酸鈉0.5ml　30mmol/L (0.75%) CuSO41.0ml　5mmol/L (0.164%) 鐵氰化鉀1.0ml 蒸餾水1.0ml　　乙酰膽堿碘鹽完全溶解于醋酸緩沖液后，依次加入其它溶液，臨用前不超過(guò)30分鐘內(nèi)配制，充分混勻，至溶液呈亮綠色，最

20、終pH5.5。,３、操作步驟(1) 新鮮組織恒冷箱切片；(2)冷丙酮或10%福爾馬林固定20-25min；(3)蒸餾水洗；(4)入孵育液37℃，１h；(5)蒸餾水洗；(6)甘油明膠封固。,４、結(jié)果與評(píng)價(jià)　　乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶活性部位顯棕色沉淀。Cu2+濃度太小易彌散，pH5-5.5，高于６易擴(kuò)散。５、對(duì)照　　用四異丙基焦磷酰胺4mM(0.137%) 0.2ml抑制膽堿酯酶顯示乙酰膽堿酯酶；　　用毒扁豆堿硫酸酯3

21、×10-5M代替蒸餾水，先將切片處理30分，水洗后入孵育液，則二種酶均被抑制呈陰性。,(二）生物學(xué)意義　　膽堿酯酶的活性中心是絲氨酸。乙酰膽堿酯酶活性的強(qiáng)弱是神經(jīng)細(xì)胞性質(zhì)和功能的重要參考指標(biāo)，亦是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程中的神經(jīng)細(xì)胞分化的一個(gè)指標(biāo)，所以在形態(tài)上將乙酰膽堿酯酶的組織化學(xué)顯示作為膽堿能傳遞部位的標(biāo)志。 AChE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，保

22、證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。,AChE與細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系。在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所用的各類細(xì)胞，正常狀態(tài)沒(méi)有AChE活性反應(yīng)，一旦發(fā)生凋亡，都有AChE活性反應(yīng)。用其特異的抑制劑可以抑制其活性反應(yīng)。用RT-PCR方法證明了凋亡細(xì)胞有AChEmRNA的轉(zhuǎn)錄。加入其抑制劑石杉?jí)A可降低凋亡基因的表達(dá)。　　乙酰膽堿酯酶主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)（大腦皮質(zhì)中有AChE陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，還存在于膽堿能神經(jīng)元中）、神經(jīng)肌肉接頭處、紅細(xì)胞等，而膽堿酯酶主要

23、分布于血清、胰腺、唾液腺內(nèi)。,五、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAc),此酶不屬于羧酸酯水解酶，它是乙酰膽堿的合成酶。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的強(qiáng)弱是膽堿能神經(jīng)生理功能的標(biāo)志，因此將ChAC確認(rèn)為膽堿能神經(jīng)的標(biāo)志酶。,（一）顯示方法——Burt法,1、反應(yīng)原理,膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可把乙酰膽堿輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到膽堿分子上,合成乙酰膽堿。輔酶A被游離出來(lái)，輔酶A中的—SH被鉛離子沉淀而顯示酶的活性。乙酰

24、輔酶A+膽堿 乙酰膽堿+輔酶A Pb2+ 沉淀產(chǎn)物 PbS↓ 硫化銨,,,2、孵育液,25mmol/L N-2-羥基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸緩沖 液（HEPES） pH6.04mmol/L

25、膽堿（48.5mg/100ml緩沖液）0.2mmol/L 乙酰膽堿輔酶A（16.2mg/100ml緩沖液）18mmol/L 硝酸鉛（59.6mg/100ml緩沖液）0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰膽堿酯酶抑 制劑）（3.8mg/100 ml緩沖液）最終pH值為6.0。,3、操作步驟,（1）固定：8μm厚的冰凍切片在10%蔗糖和2%戊二醛的25mmol/LHEPES緩

26、沖液（pH7.0）中固定5min；（2）漂洗：用含10%蔗糖的HEPES緩沖液洗15min×3；（3）孵育：切片入孵育液中，室溫，3h；（30℃，15-30min）；（4）蒸餾水洗3次；（5）1%硫化銨顯色2min；（6）緩沖液漂洗，甘油明膠封固。,4、結(jié)果：酶活性部位呈黑色沉淀。5、對(duì)照：（1）孵育液中可除去輔酶A；（2）孵育液中去除膽堿，反應(yīng)結(jié)果為陰性。,（二）生物學(xué)意義 ChAc是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)

27、志酶，是乙酰膽堿的合成酶，分布在膽堿能神經(jīng)元和纖維內(nèi)，其含量的多少，可說(shuō)明神經(jīng)興奮性的高低，能充分反映神經(jīng)的功能。是了解膽堿能神經(jīng)元及其所支配器官的重要指標(biāo)。AChE是乙酰膽堿的水解酶，其特性沒(méi)有ChAc高，兩酶相結(jié)合作觀察指標(biāo)最為理想。,六、脂酶(Lipase)　　脂酶又名甘油酯水解酶，能催化長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯或其它醇酯水解?！　〖せ顒篊a2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巰基乙酸、?；悄懰猁}。（一）顯示方法——硫化鉛法（吐溫

28、法之一，Gomori,1954)１、基本原理　　以長(zhǎng)鏈脂肪酸酯為底物，在脂酶作用下，分離出的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，再用鉛置換鈣，最后經(jīng)硫化胺置換生成棕黑色硫化鉛沉淀。,吐溫,,脂酶,脂肪酸+Ca2+,,鈣皂,,,鉛置換鈣,硫化胺,PbS,,２、孵育液　5%吐溫60或80硬脂酸酯（油酸酯）2ml　0.2mol/L Tris緩沖液(pH7.2-7.4)5ml　10%氯化鈣2ml　蒸餾水40ml,３

29、、操作步驟(1)恒冷箱切片；(2)入孵育液，37℃,２－３小時(shí)；(3)1%CaCL２液內(nèi)浸洗，使鈣皂不溶；(4) 1%Pb(NO3)2浸15min，（置換）；(5)流水沖洗5分；(6)0.5-1%硫化胺液內(nèi)１min，（顯色）；(7)水洗３分；(8)甘油明膠封片。,４、結(jié)果與評(píng)價(jià)　　棕黑色硫化鉛沉淀為脂酶活性所在部位。本法需保持Ca2+濃度，才有利于在Pb(NO3)2液內(nèi)進(jìn)行充分置換反應(yīng)。孵化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易彌散。５、對(duì)照

30、　　去出吐溫60（底物）為陰性,（二）生物學(xué)意義,脂酶在體內(nèi)主要催化甘油三酯水解，使之成為二酰甘油和脂肪酸，甘油三酯必須在脂酶將它分解成甘油和脂肪酸后，才能被腸道吸收。脂肪細(xì)胞也需要脂酶水解脂肪，以保證脂肪的外運(yùn)。 脂酶的定位和組織分布：脂酶主要存在于胞質(zhì)的基質(zhì)，高爾基復(fù)合體和線粒體也可出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。胰腺最為豐富，其次是肝臟、腎臟、脾臟、唾液腺導(dǎo)管（但大鼠極少）、胃賁門(mén)、睪丸基質(zhì)細(xì)胞中也存在。,氧化酶和脫氫酶,Oxidase

31、 and Dehydrogenase,一、氧化還反應(yīng)1. 生物體內(nèi)的氧化方式(1) 脫電子反應(yīng)：從底物上脫落一個(gè)電子?！　　　　　e 2+ → Fe 3+ + e(2) 脫氫反應(yīng)：從底物上脫落一對(duì)氫原子?！　　　　　H2 → M + 2H (2H+ + 2e)(3) 加氧反應(yīng)：向底物中直接加入氧原子或氧分子。　　催化上述反應(yīng)的酶，稱氧化還原酶?！　　　∈茈娮芋w、受氫體與供電子體、供氫體,氧化反應(yīng)：分解代謝中失電

32、子、脫氫、加氧。還原反應(yīng)：合成代謝中得電子、加氫、脫氧。還原劑：供電子體Fe2+(亞鐵離子）。氧化劑：受電子體（或受氫體)Fe3+(高鐵離子）。,根據(jù)受氫體的不同，氧化還原酶分為：氧化酶：催化氫原子直接轉(zhuǎn)移到氧分子上。脫氫酶：催化氫原子轉(zhuǎn)移到其它受氫體上，催化氧化過(guò)程的中間環(huán)節(jié)。,常見(jiàn)的受氫體有：輔酶Ⅰ（NAD+，nicotinamide adenine dinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）；輔酶Ⅱ（NADP

33、+, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）；黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD, Flavin - adenine dinucleotide),2. 電子傳遞鏈　營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)經(jīng)三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化等不同氧化分解途徑，脫氫氧化。脫下的氫大多由NAD+、NADP+、FAD接受，NAD+、FAD是常見(jiàn)脫氫酶的輔酶或輔基。這些脫氫酶是連接代謝途徑和電子傳遞鏈的

34、環(huán)節(jié)。代謝物脫下一對(duì)氫，分別以NADH + H+或FADH2進(jìn)入電子傳遞鏈，最終與氧結(jié)合生成水，并釋放能量。電子只能從電子親和力低的傳遞體向親和力高的傳遞體傳遞。,,,二、細(xì)胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase, CCO)　細(xì)胞色素(Cytochrome, cyt)是生物細(xì)胞內(nèi)一類傳遞蛋白質(zhì)，含有鐵呋啉輔基，具有紅色而取名細(xì)胞色素?！‰娮觽鬟f鏈中有5種不同細(xì)胞色素：b、c、c1、a、a3， b、c、c1的輔基都含鐵原呋

35、呤（血紅素），鐵原子與呋呤環(huán)和蛋白質(zhì)形成六個(gè)配位鍵，不能再與氧結(jié)合。,細(xì)胞色素Ｃ是一種水溶性的膜表面蛋白，還原性的細(xì)胞色素Ｃ把它的電子傳遞給細(xì)胞色素氧化酶Cytaa3，細(xì)胞色素a和a3結(jié)合緊密，一般分離方法不能將它們分開(kāi)，形成一個(gè)大分子寡聚體，通常稱為細(xì)胞色素aa3,　Fe與呋呤環(huán)和蛋白質(zhì)形成五個(gè)配位鍵，還保留一個(gè)配位鍵和O2、CO和CN-（氰基）結(jié)合，是電子傳遞鏈中能與氧進(jìn)行反應(yīng)的復(fù)合物，能催化分子氧接受電子而被還原，稱細(xì)胞色素氧化酶

36、或細(xì)胞色素Ｃ氧化酶。　細(xì)胞色素氧化酶使還原的細(xì)胞色素Ｃ再氧化，是線粒體的結(jié)構(gòu)成分之一。,（一）顯示方法,1、Nadi氧化酶反應(yīng)（Naphthol-diamine, 萘酚二胺）　（1）反應(yīng)原理,O2,（2）孵育液 N-苯基-對(duì)苯二胺 （底物） 3mg 1-羥基-2-萘酚 3mg 二甲基亞砜 0.1ml0.05mol/L磷酸緩沖液pH7.

37、2 10ml混勻，過(guò)濾。,（3）操作步驟： 1）新鮮組織，恒冷箱切片； 2）入孵育液中，室溫，20—30min； 3）入Lugol碘液2min；（穩(wěn)定有色產(chǎn)物） 4）入5%硫代硫酸鈉溶液4min；（脫碘） 5）入1%醋酸鈷液中60min；（有色產(chǎn)物螯合） 6）D.W洗； 7）甘油明膠封固。,（4）結(jié)果： 酶活性部位呈棕黑色顆粒。（5）對(duì)照：標(biāo)本孵育于含氰化鉀（0.0065g/10ml)的

38、孵育液中，呈陰性反應(yīng)。,2. 二氨基聯(lián)苯胺法（DAB法, diaminobenzidine）,1、原理　細(xì)胞色素氧化酶（CCO）能催化DAB，被H2O2氧化，在新鮮或固定標(biāo)本上生成棕色沉淀。　DAB鹽酸鹽溶于水后無(wú)色透明，但由于CCO的作用，側(cè)鏈氨基被氧化，進(jìn)行反復(fù)氧化性聚合和氧化性環(huán)化，形成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚合體。,(2) 孵育液 蒸餾水 5ml

39、 3,3’-二氨基聯(lián)苯胺-4鹽酸鹽 5mg 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.4) 5ml 過(guò)氧化氫酶 c-100 1mg 或 c-40 4mg 細(xì)胞色素C III型 10mg 或 IV 5mg,（3

40、）操作步驟： 1）組織塊浸泡固定：戊二醛固定液（3%戊二醛，0.1mol/L PB pH7.4, 0.05%CaCl2，二甲砷酸鹽緩沖液），4℃，10min; 2）洗滌：冷固定液15min，3次； 3）恒冷箱切片； 4）孵育：37 ℃，40-60min，充分洗滌； 5）復(fù)染； 6）封片。,（4）結(jié)果,酶活性部位呈茶褐色沉淀，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目多者酶活性強(qiáng)。（5） 對(duì)照

41、 孵育液內(nèi)加1mM K-CN或10mM NaN3，反應(yīng)完全呈陰性。抑制劑為氰化物、迭氮化鈉（NaN3）、硫化氫（H2S）、一氧化碳，原因是這些物質(zhì)均能與細(xì)胞色素氧化酶的三價(jià)鐵結(jié)合而抑制酶活性。從反應(yīng)液中去掉底物DAB不能成為對(duì)照，因?yàn)镈AB同時(shí)也是成色劑。,DAB將氧化型細(xì)胞色素Ｃ還原，還原型細(xì)胞色素Ｃ又被細(xì)胞色素a再氧化，反復(fù)循環(huán)進(jìn)行，DAB不斷被氧化，反應(yīng)氧化物沉淀沉積。 此法從反應(yīng)特異性、重復(fù)性和電鏡應(yīng)用等方面最好，用得最

42、普遍。 DAB法是研究代謝旺盛細(xì)胞線粒體的有效手段。,骨骼肌,DAB法顯示CCO,腎皮質(zhì),,腎髓質(zhì),,（二）生物學(xué)意義,幾乎所有組織細(xì)胞都呈陽(yáng)性反應(yīng)，其強(qiáng)度取決于細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)目，是線粒體的標(biāo)志酶之一。是研究代謝旺盛細(xì)胞線粒體的有效手段。心肌、腎小管上皮、胃壁細(xì)胞、肝細(xì)胞活性均較高，惡性腫瘤和癌前期酶活性有增高趨勢(shì)。,三、DOPA氧化酶(Catechol Oxidase)　也稱兒茶酚氧化酶，酪氨酸酶。1、反應(yīng)原理　以DO

43、PA(dihydroxyphenylalanine, 二羥苯基丙氨酸）為底物，氧化后經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)生成黑色產(chǎn)物。2、 孵育液　5.6mmon/L二羥苯基丙氨酸，溶于0.1mol/L磷酸緩沖液中，pH7.4。,3. 操作步驟(1) 新鮮組織，厚5mm, 10%福爾馬林室溫固定1h;(2) 流水沖3分；(3) 入孵育液，37℃1h;(4) 換孵育液，37℃12-15h;(5) 流水沖洗；(6) Bouin液固定24h;(

44、7) 酒精脫水，透明，石蠟包埋；(8) 切片6-8微米，可復(fù)染；(9) 樹(shù)膠封片。,4. 結(jié)果　酶活性部位呈黑棕色顆粒。5. 對(duì)照　去底物或用氰化物6. 生物學(xué)意義　對(duì)診斷惡性黑素瘤有意義。,四、單胺氧化酶(Monoamine Oxidase, MAO)　又稱腎上腺素氧化酶，酪胺酶。1、反應(yīng)原理　 MAO是催化芳香族、脂肪族單胺類氧化脫氨基的酶，屬黃素酶，以FAD為輔基。反應(yīng)產(chǎn)物有醛和H2O2。利用它們的還原性或氧

45、化性進(jìn)行組化染色。,反應(yīng)產(chǎn)物有醛和H2O2，利用醛的還原性和H2O2的氧化性進(jìn)行組化染色。(1) 醛還原作用,氧化,氧化,還原,(2) H2O2的氧化作用　利用產(chǎn)生的H2O2經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化，將芳香胺氧化顯色。,HRP,2. 孵育液——四唑鹽法　鹽酸色胺（底物） 25mg 無(wú)水硫酸鈉 4mg NBT（四唑鹽） 4mg 0.1mol/LPBS(pH7.6)5ml

46、蒸餾水15ml,3. 操作步驟(1)新鮮冰凍切片；(2)入孵育液，37℃ 30-60min；(3)流水沖洗2min；(4)4%多聚甲醛固定24h;(5)洗滌，脫水，甘油明膠封片。,4. 結(jié)果　酶反應(yīng)陽(yáng)性部位見(jiàn)藍(lán)色或紫色甲簪顆粒。5. 對(duì)照　去色胺底物。,6. 生物學(xué)意義： (1)含生物活性胺組織：腎上腺髓質(zhì)，APUD細(xì)胞(2)參與毒性胺解毒組織：肝細(xì)胞、腎小管、腸粘膜上皮。,五、輔酶非依賴性脫氫酶－琥珀酸脫氫

47、酶　　(Succinate dehydrogenase, SDH)1、反應(yīng)原理——四唑鹽法　 琥珀酸被SDH氧化為延胡索酸，脫氫通過(guò)中間受氫體吩嗪甲基硫酸酯（PMS)，把四唑鹽(NBT)還原為二甲簪。,,,還原,2. 孵育液　TNBT（2,2’,5,5’-四對(duì)硝基苯-3,3’-氯化雙四唑） 2.5mg 0.1mol/L PBS(pH7.6)5ml 琥珀酸鈉 81mg 蔗糖

48、 250mg D.W加至 10ml,3. 操作步驟(1)新鮮組織冰凍切片；(2)入孵育液37℃,30min；(3)PBS沖洗；(4)福爾馬林鈣固定10min；(5)80%酒精洗5min；(6)甘油明膠封固。4. 結(jié)果　陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈細(xì)小紫藍(lán)色顆粒。,5. 對(duì)照(1)去琥珀酸底物；(2)加0.1M丙二酸鹽與SDH競(jìng)爭(zhēng)性抑制；(3)加熱

49、使細(xì)胞內(nèi)酶失活。6. 生物學(xué)意義　三羧酸循環(huán)標(biāo)志酶；心、肝、腎豐富；定位線粒體。,六、輔酶依賴性脫氫酶－乳酸脫氫酶　?。↙actate dehydrogenase, LDH)1、反應(yīng)原理 　從反應(yīng)生成的NADH，通過(guò)受氫體PMS（吩嗪硫酸甲脂）供給四唑鹽，將其還原為甲簪。,2. 孵育液NBT 10mg0.1mol/L PBS(pH7.8) 8ml PMS吩嗪甲基硫酸酯 37℃溶解

50、 1mg4%乳酸鈉 2mlNAD+ 5mg,3. 操作步驟(1)恒冷箱切片，吹干入孵液，37℃,15min，避光；(2)蒸水洗；(3)福爾馬林鈣固定15分以上；(4)蒸水洗；(5)甘油明膠封片。4. 對(duì)照(1)去底物乳酸鈉(2)去NAD+,5. 結(jié)果　酶活性部位呈紫藍(lán)色甲簪沉淀。6. 生物學(xué)意義　凡能進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞都有此酶存在，細(xì)胞損傷可有此酶釋出。,有五種同工