紅鰭東方鲀4個免疫基因的原核表達及群體EST-SSRs分析.pdf

1、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)的肉質鮮美,食用價值高,深受人們的歡迎。紅鰭東方鲀的肝臟和生殖腺等內臟可產生河豚毒素,具有很高的活性和特異性,所以在醫(yī)藥開發(fā)方面具有潛在的價值,在臨床上其應用前景較為廣闊。但與常規(guī)養(yǎng)殖魚類相比,紅鰭東方鲀的生物學特性比較復雜、特殊,所以比較容易受到外界環(huán)境因子的影響,故疾病發(fā)生率較高。在病原侵襲機體時,免疫系統(tǒng)起著重要的作用,其主要由免疫細胞,免疫器官和免疫分子(如白細胞介素)組成。白細胞

2、介素7(IL-7)、IL-15、IL-15L和干擾素調節(jié)因子2(IRF2)是魚類免疫系統(tǒng)中較為重要的免疫分子。
　　(1)本論文利用cDNA末端快速擴增技術(RACE)從紅鰭東方鲀頭腎組織中克隆出了干擾素調節(jié)因子2(IRF2),全長cDNA為1552bp,其ORF為936bp,編碼311個(aa)氨基酸,推導的氨基酸分子量為35.5kDa,等電點為6.56。其中5’非編碼區(qū)為187bp,3’非編碼區(qū)為429bp。經過分析發(fā)現,紅鰭

3、東方鲀IRF2可能為親水蛋白,無信號肽和跨膜結構,具有DNA結合域(DBD)、IRF結合域2(IAD2)和轉錄抑制域(TRD)。與其他物種同源性分析發(fā)現,紅鰭東方鲀IRF2與鱖魚(S.chuatsi)的相似度最高,達79％,這些為以后對此基因功能機制的了解以及深入探討提供了基礎。
　　(2)根據NCBI網站上已發(fā)表的紅鰭東方鲀IL-7、IL-15、IL-15L基因和克隆的IRF2基因,設計并合成了用于原核表達的特異性引物,利用PC

4、R技術克隆其成熟肽或編碼區(qū)的核苷酸序列,并成功構建了pET32a-IL-7、pET32a-IL-15、pET32a-IL-15L、pET32a-IRF2和pET28a-IL-7重組質粒,并分別在BL21(DE3)和Rosetta(DE3)細胞中成功誘導表達,得到了相應的融合蛋白。另外,通過優(yōu)化表達條件找到了各個基因表達的最佳菌株、IPTG誘導濃度、誘導時間以及誘導溫度的等條件,為進一步表達和大規(guī)模生產提供了技術支持和便利。純化出的目的蛋

5、白為后續(xù)的生物活性測定和免疫疫苗的制備奠定了基礎。
　　(3)從NCBI網站的數據庫下載紅鰭東方鲀的基因組序列和EST序列,然后用SSR-Hunter軟件查找微衛(wèi)星核心序列,利用35個EST-SSR基因位點的特性對57個紅鰭東方鲀個體樣本進行研究。結果表明,每個基因位點有2~7個等位基因數,有效等位基因的平均值為3.3675。觀測雜合度范圍為0.2281~0.7368,平均值為0.4924,而期望雜合度在0.4986~0.8235

6、之間,平均值為0.6859。多態(tài)信息含量(PIC)在0.3712~0.7904之間,平均值為0.6264。Hardy-weinberg(HWE)平衡結果顯示,31個位點有15個處于平衡狀態(tài)(P>0.01),16個位點都發(fā)生了不同程度的偏離。導致了微衛(wèi)星位點偏離平衡的原因可能是養(yǎng)殖群體的個體之間有一定的親緣關系。
　　(4)對紅鰭東方鲀微衛(wèi)星標記與體長、體高和體重生長性狀進行了相關性分析,并對紅鰭東方鲀微衛(wèi)星JX448611、JX4