無(wú)乳鏈球菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性和比較基因組學(xué)分析.pdf

1、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae），又稱(chēng)B群鏈球菌(groupBstreptococcus，GBS)，可致新生兒腦膜炎和敗血癥，牛乳腺炎，魚(yú)類(lèi)的腦膜腦炎。其中，無(wú)乳鏈球菌引致的牛隱形乳腺炎對(duì)牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量有重大影響。
　　噬菌體能夠裂解細(xì)菌。隨著細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題日益突出，作為一種可替代抗生素的抗菌制劑，噬菌體及其裂解酶等受到了廣泛關(guān)注。另外，噬菌體在全球生物圈的生態(tài)平衡和細(xì)菌的演化中扮演了重要的角色。無(wú)

2、乳鏈球菌的噬菌體研究起步較早，但發(fā)展緩慢，目前還沒(méi)有無(wú)乳鏈球菌噬菌體全基因組序列的報(bào)道。
　　分離了4株特異裂解牛源無(wú)乳鏈球菌的噬菌體，對(duì)其中兩株噬菌體進(jìn)行了生物學(xué)特性和比較基因組學(xué)分析，鑒定了其裂解酶的功能。同時(shí)，篩選了這2株噬菌體的溶原株，對(duì)溶原株的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。
　　1.無(wú)乳鏈球菌噬菌體的分離與鑒定
　　采用兩種分離方法分離無(wú)乳鏈球菌的噬菌體:從自然環(huán)境樣品分離以及從溶原菌中誘導(dǎo)分離。兩種方法共分離到了4

3、株噬菌體，其中噬菌體LYGO9、JX01和HZ04分離于乳腺炎奶樣中，pA11誘導(dǎo)自無(wú)乳鏈球菌HAJL2011070601。電鏡觀(guān)察4株噬菌體均具有長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae）成員的特點(diǎn)，頭部呈正六邊形，直徑約50nm，尾部無(wú)伸縮性，長(zhǎng)度約200nm。4株噬菌體均特異性裂解牛源無(wú)乳鏈球菌菌株。對(duì)42株牛源無(wú)乳鏈球菌分離株的裂解情況分別為，LYGO9裂解12/42(28.6％)、JX01裂解23/42(54.8％)、HZ04裂

4、解20/42(47.6％)和pA11裂解13/42(31％)。EcoRⅠ、SalⅠ、XbaⅠ和PstⅠ酶切這4株噬菌體DNA呈現(xiàn)不同的酶切圖譜。與30％甘油4℃保存和7％DMSO液氮中保存的方法相比，上述4株噬菌體于SM液中4℃保存的效果最好。
　　2.無(wú)乳鏈球菌的噬菌體LYGO9和JX01的生物學(xué)特性
　　為確定LYGO9和JX01宿主范圍的特異性和差異性是否與噬菌體的吸附有關(guān)，測(cè)定了LYGO9和JX01吸附曲線(xiàn)，比較了二

5、者對(duì)不同菌株的吸附譜。結(jié)果顯示，這2株噬菌體于37℃與宿主菌TZ201102作用15min，均可90％以上吸附;二者的吸附譜并無(wú)明顯差異，然而裂解譜卻差異較大。受體阻斷試驗(yàn)表明，多糖是可能的受體。此外，測(cè)定了LYGO9和JX01的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，LYGO9的潛伏期僅5min，JX01的潛伏期達(dá)30min，二者的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別為25min和20min，裂解量分別為30PFU/cell和20PFU/cell。這2株噬菌體與其相應(yīng)的宿

6、主菌的最適MOI均為0.01;對(duì)熱敏感，60℃處理30min存活率＜1％;有一定的酸堿耐受性，尤其是JX01在pH(3-11)的條件下作用1h，其滴度仍能保持在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)。SDS-PAGE分析其結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)現(xiàn)二者具有相似的6條結(jié)構(gòu)蛋白條帶，其中，32kD的條帶豐度最高。
　　3.無(wú)乳鏈球菌噬菌體LYGO9和JX01基因組測(cè)序及比較基因組學(xué)分析
　　采用高通量測(cè)序的方法測(cè)定噬菌體LYGO9和JX01的基因組。二者的基因組呈模

7、塊化構(gòu)成，包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA包裝、裂解、形態(tài)和溶原幾個(gè)基因模塊。LYGO9基因組呈線(xiàn)狀排列，為雙股DNA分子，由41660個(gè)核苷酸組成，GC含量為36.73％。JX01也為線(xiàn)狀雙股DNA分子，由43028個(gè)核苷酸組成，GC含量為36.81％。LYGO9和JX01被分別預(yù)測(cè)有66和70個(gè)ORFs。二者具有一個(gè)相同的tRNA—tRNA(get)。比較基因組分析表明，LYGO9和JX01具有相同的DNA包裝、宿主裂解和形態(tài)基因模塊，而

8、復(fù)制、調(diào)控及溶原相關(guān)的基因不同。與其他鏈球菌的前噬菌體基因組比較分析表明:二者與化膿鏈球菌MGAS9429和MGAS315的前噬菌體之間存在基因的水平轉(zhuǎn)移;與化膿鏈球菌MGAS9429和MGAS315的前噬菌體之間的同源性高于無(wú)乳鏈球菌前噬菌體LambdaSa01和LambdaSa03。迄今為止，尚無(wú)無(wú)乳鏈球菌噬菌體的全基因組的報(bào)道，描述的LYGO9和JX01的基因組，是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。
　　4.噬菌體LYGO9和JX01裂解酶基

9、因的表達(dá)純化及活性鑒定
　　噬菌體LYGO9和JX01的裂解酶推測(cè)分別由orf16和orf44編碼。生物信息學(xué)分析二者具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:肽鏈內(nèi)切酶活性有關(guān)的CHAP結(jié)構(gòu)域和與溶菌酶活性有關(guān)的GH25-Cpll-like的結(jié)構(gòu)域。LYGO9和JX01的裂解酶基因的DNA和氨基酸同源性達(dá)98％以上，不同的氨基酸均位于CHAP結(jié)構(gòu)域中。為驗(yàn)證orf16和orf44的功能，將LYGO9和JX01的裂解酶基因的全長(zhǎng)和CHAP結(jié)構(gòu)域分別插

10、入至pET-32a(+)中構(gòu)建重組表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組蛋白O91ysa、O91ys12a、011ysa和011ys12a。4個(gè)重組蛋白用鎳柱純化后進(jìn)行酶活試驗(yàn)，均能在相應(yīng)的位置形成透明的條帶，表明LYGO9和JX01的裂解酶基因及CHAP結(jié)構(gòu)域經(jīng)體外重組表達(dá)后均具裂解宿主菌TZ201102細(xì)胞壁的生物學(xué)活性。
　　5.無(wú)乳鏈球菌溶原菌株的篩選及特性分析
　　無(wú)乳鏈球菌基因組

11、中存在大量噬菌體相關(guān)的基因，這些基因大約占無(wú)乳鏈球菌所有菌特異性基因的10％左右。然而，這些噬菌體基因的功能很少研究，它們與無(wú)乳鏈球菌致病性的關(guān)系也不得而知。有鑒于此，篩選了無(wú)乳鏈球菌噬菌體LYGO9和JX01分別溶原感染TZ201102的溶原株O9RTZ201102和01RTZ201102;根據(jù)LYGO9和JX01具有不同溶原基因簇，篩選了LYGO9和JX01同時(shí)溶原感染TZ201102的溶原株O901RTZ201102;另外，篩選了

12、JX01溶原感染另一株宿主菌CH201102的溶原株01RCH201102。測(cè)定溶原株和野生株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，比較了各菌株形成生物被膜能力及對(duì)小鼠的致病性。結(jié)果表明，與野生株相比，溶原株O9RTZ201102和01RCH201102的生物被膜形成能力顯著降低;各溶原菌株僅對(duì)其相應(yīng)的噬菌體免疫，對(duì)其他同源性較高的噬菌體仍然易感;01RTZ201102對(duì)小鼠的毒力與野生株相比差異不大，其他溶原株的毒力均有減弱，其中O901RTZ201102感染