維生素的測(cè)定

1、一、維生素的故事,人類對(duì)維生素的認(rèn)識(shí)始于3000多年前。當(dāng)時(shí)古埃及人發(fā)現(xiàn)夜盲癥可以被一些食物治愈，雖然他們并不清楚食物中什么物質(zhì)起了醫(yī)療作用，這是人類對(duì)維生素最朦朧的認(rèn)識(shí)。,第一節(jié) 概述,1519年，葡萄牙航海家麥哲倫率領(lǐng)的遠(yuǎn)洋船隊(duì)從南美洲東岸向太平洋進(jìn)發(fā)。三個(gè)月后，有的船員牙床破了，有的船員流鼻血，有的船員渾身無力，待船到達(dá)目的地時(shí)，原來的200多人，活下來的只有35人，人們對(duì)此找不出原因。,1734年，在開往格陵蘭的海船上，有一個(gè)

2、船員得了嚴(yán)重的壞血病，當(dāng)時(shí)這種病無法醫(yī)治，其他船員只好把他拋棄在一個(gè)荒島上。待他蘇醒過來，用野草充饑，幾天后他的壞血病竟不治而愈了。諸如此類的壞血病，曾奪去了幾十萬英國(guó)水手的生命。1747年英國(guó)海軍軍醫(yī)林德總結(jié)了前人的經(jīng)驗(yàn)，建議海軍和遠(yuǎn)征船隊(duì)的船員在遠(yuǎn)航時(shí)要多吃些檸檬，他的意建被采納，從此未曾發(fā)生過壞血病。但那時(shí)還不知檸檬中的什么物質(zhì)對(duì)壞血病有抵抗作用。,第一節(jié) 概述,1912年，波蘭科學(xué)家豐克，經(jīng)過千百次的試驗(yàn)，終于從米糠中提取

3、出一種能夠治療腳氣病的白色物質(zhì)。這種物質(zhì)被豐克稱為 “維持生命的營(yíng)養(yǎng)素”，簡(jiǎn)稱Vitamin(維他命），也稱維生素。隨著時(shí)間的推移，越來越多的維生素種類被人們認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)，維生素成了一個(gè)大家族。人們把它們排列起來以便于記憶，維生素按A、B、C一直排列到L、P、U等幾十種。,第一節(jié) 概述,維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有30余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。

4、這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺(tái)物。,維生素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜： 分為： 胺類（B1） 醛類（B6） 醇類（A） 酚 醌類等,維生素的命名,多根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序以英文字母排序，如維生素A、維生素B1、B2，維 生 素

5、C， 維生素E等。根據(jù)特定生理功能，如抗干眼病因子、抗壞血酸、生育酚等。按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)如視黃醇、硫胺素、煙酸、葉酸等。,維生素都具有以下共同特點(diǎn)：,化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；不能供給機(jī)體熱能，也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量極小；一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要必須經(jīng)常從食物中攝??；長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。,維生素A缺乏時(shí)的具體表現(xiàn)為

6、：,影響視覺，眼睛的結(jié)膜、角膜干燥，暗適應(yīng)減弱，乃至夜盲。 皮膚干燥、脫屑，上皮組織改變，腺體分泌減少。 免疫力降低，反復(fù)呼吸道感染、腹瀉。 頭發(fā)干枯、易斷，指甲無光澤。 牙質(zhì)萎縮，骨骼發(fā)育不良。 味覺、嗅覺不佳、食欲差，生長(zhǎng)發(fā)育停滯。 影響智力發(fā)育。,測(cè)定食品中維生素含量的意義,評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值； 尋找富含維生素的食品資源； 指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止維生素缺乏癥或維生素中毒；  研究維生素在食品加工

7、、貯存等過程中的穩(wěn)定性，指導(dǎo)人們制定合理的加工工藝及貯存條件； 監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的強(qiáng)化劑量，防止因攝入過多而引起維生素中毒。,脂溶性維生素 ：溶于脂肪或脂溶劑，在食物中與脂類共存的一類維生素，包括A、D、E、K 各小類，其共同特點(diǎn)：是攝入后存在于脂肪組織中，不能從尿中排除，大劑量攝入時(shí)可能引起中毒；由于可儲(chǔ)藏在脂肪中，故不需每天供給。 水溶性維生素 ：溶于水，包括B、C 各小類，其共同特點(diǎn)：是一般只存在于植物性食品中，滿足組織需

8、要后都能從機(jī)體排出。需要每天供給。,維生素的分類,維生素的分析方法,第二節(jié) 脂溶性V的測(cè)定,VA、VD、VE、與類脂類物質(zhì)一起存于食物中，攝食時(shí)可吸收，可在體內(nèi)積貯。 脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)： 1．溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。 2．耐酸堿性：維生素A、D對(duì)酸不穩(wěn)定， 對(duì)堿穩(wěn)定，維生素E對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。,3．

9、耐熱性、耐氧化性： 耐熱性 氧化性VA 好，能經(jīng)受煮沸 易被氧化 （光、熱 促進(jìn)其氧化）V D 好，能經(jīng)受煮沸 不易被氧化 V E

10、 好，能經(jīng)受煮沸 在空氣中能慢慢被化 （光、熱、堿促進(jìn)其 氧化）,根據(jù)上述性質(zhì)．測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：皂化樣品 水洗去除類脂物

11、 有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物) 濃縮 溶于適當(dāng)?shù)娜軇?測(cè)定。 在皂化和濃縮時(shí)，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等)。 對(duì)于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。,國(guó)際單位： IU （International U

12、nit) 1 IU = 0.3μg VA = 0.025 VD = 1.79 μgβ-胡蘿卜素 = 1.1mg α- VE = 3 μg VB,一、維生素A的測(cè)定 維生素A存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閂A，故稱為VA原。,維生素A的性質(zhì),⑴ 因有許多不飽和鏈，故見光易分解；

13、 ⑵ 在缺氧情況下，對(duì)熱較穩(wěn)定，對(duì)光特別敏感。 ⑶ 對(duì)堿穩(wěn)定。,目前維生素A都是合成的，來源：（1）從動(dòng)物肝臟中得到；（2）從維生素前體而得到（維生素前體：主要指類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素） 維生素A的測(cè)定常用的方法有: 三氯化銻比色法 紫外分光光度法 熒光分析法 液相色譜法。,,比色法測(cè)定VA的含量（GB/T 5009.82—2003中第二法

14、）（一） 原理 在氯仿溶液中，VA與三氯化銻可生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在 620 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸光度與VA的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測(cè)定。,（二）適用范圍及特點(diǎn)本法適用于維生素A含量較高的各種樣品(高于 5~10μg／g)，對(duì)低含量樣品，因受其他脂溶性物質(zhì)的干擾。不易比色測(cè)定。該法的主要缺點(diǎn)是生成的藍(lán)色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差。比色測(cè)定必須在 ，否則藍(lán)色會(huì)迅速

15、消退，將造成極大誤差。,6秒鐘內(nèi)完成,2.儀器 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備 分光光度計(jì) 回流冷凝裝置 3.試劑 本實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水 （1） 無水硫酸鈉 Na2SO4 （2） 乙酸酐 （3） 乙醚 （不含有過氧化物） （4） 無水乙醇 （不含有醛類物質(zhì)） （5） 三氯甲烷 （不含分解物，否則會(huì)破壞維生素A ）,檢查方法：三氯甲烷不穩(wěn)定，放置后易受空氣中氧的作用生成氯化氫。檢查時(shí)可取少量

16、三氯甲烷置試管中加水振搖，使氯化氫溶到水層。加入幾滴硝酸銀溶液，如有白色沉淀即說明三氯甲烷中有分解產(chǎn)物。 （6） 25%三氯化銻-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化銻溶液，儲(chǔ)于棕色瓶中（注意避免吸收水分） （7） 50%氫氧化鉀溶液（KOH） W/V （8） 維生素A標(biāo)準(zhǔn)液 視黃醇（純度85% Sigma）用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。

17、（9） 酚酞指示劑 用95%乙醇配制1%溶液,4. 操作步驟 　　維生素A極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行。 4.1樣品處理：根據(jù)樣品性質(zhì)，可采用皂化法或研磨法。 (1)皂化法：皂化：根據(jù)樣品中維生素A含量的不同，稱取0.5g～5g樣品于三角瓶中，加入20～40mL無水乙醇及10mL50%氫氧化鉀，于電熱板上回流30min至皂化完全為止。（皂化法適用于維生素A含量不高的樣品，可減少脂溶性物質(zhì)的干擾，但全部實(shí)驗(yàn)過程

18、費(fèi)時(shí)，且易導(dǎo)致維生素A 損失）,提取：將皂化瓶?jī)?nèi)混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脫脂棉漏斗濾入分液漏斗內(nèi)。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣，靜置分層后，水層放入第二個(gè)分液漏斗內(nèi)。皂化瓶再用約30mL乙醚分二次沖洗，洗液傾入第二個(gè)分液漏斗中。振搖后，靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個(gè)分液漏斗合并。重復(fù)至水液中無維生素A為止。,洗滌：

19、 用約30mL水加入第一個(gè)分液漏斗中，輕輕振搖，靜置片刻后，放去水層。加15 ～20mL 0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中，輕輕振搖后，棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。繼續(xù)用水滌，每次用水約30mL，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止（大約洗滌3次）。醚層液靜置10～20min，小心放出析出的水。,濃縮： 將醚層液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入

20、三角瓶?jī)?nèi)。置水浴上蒸餾，回收乙醚。待瓶中剩約5mL乙醚時(shí)取下，用減壓抽氣法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。,(2)研磨法：　研磨：精確稱2～5g樣品，放入盛有3～5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收，并均質(zhì)化。（研磨法適用于每克樣品維生素A含量大于5～10μg樣品的測(cè)定，如肝樣品的分析。步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確） 　提?。盒⌒牡貙⑷烤|(zhì)化樣品移入帶蓋的三角瓶?jī)?nèi)，

21、準(zhǔn)確加入50～100ml乙醚。緊壓蓋子，用力振搖2min，使樣品中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大約需1～2h），或離心澄清（因乙醚易揮發(fā)，氣溫高時(shí)應(yīng)在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應(yīng)事先置于冷水浴中）。 濃縮：取澄清提取乙醚液2～5mL，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽氣蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解殘?jiān)?,,4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備: 準(zhǔn)確取一定量的維生素A標(biāo)準(zhǔn)液于4～5個(gè)容量

22、瓶中，以三氯甲烷配制標(biāo)準(zhǔn)系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1mL三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成標(biāo)準(zhǔn)比色系列。于620nm波長(zhǎng)處，以三氯甲烷調(diào)節(jié)吸光度至零點(diǎn)，將其標(biāo)準(zhǔn)比色列按順序移入光路前，迅速加入9mL三氯化銻-三氯甲烷溶液。于6秒內(nèi)測(cè)定吸光度，將吸光度為縱坐標(biāo)，以維生素A含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。,4.3樣品測(cè)定: 于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入一滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入1

23、mL三氯甲烷，其余比色管中分別加入1mL樣品溶液及1滴乙酸酐。其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。,注意：維生素A見光易分解，整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在暗處進(jìn)行，防止陽光照射，或采用棕色玻璃避光。2. 三氯化銻腐蝕性強(qiáng)，不能沾在手上，三氯化銻遇水生成白色沉淀。因此用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。,說明：,1，本法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于食品中維生素Ａ的測(cè)定。2，乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象，在提取前，洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)

24、生乳化，可加幾滴乙醇消除乳化。3，所用氯仿中不應(yīng)含有水分，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)深沉，干擾比色測(cè)定。故在每1mL氯仿中應(yīng)加入乙酸酐１滴，以保證脫水。,４，由于三氯化銻與維生素Ａ所產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)很不穩(wěn)定，通常6s以后便開始褪色，因此要求反應(yīng)在比色皿中進(jìn)行，產(chǎn)生藍(lán)色后立即讀取吸光度值。5，如果樣品中含β－胡蘿卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干擾測(cè)定，可將濃縮蒸干的樣品用正己烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮－己烷混合液為洗脫劑進(jìn)行柱

25、層析。,二、維生素D的測(cè)定,維生素D是指含有抗佝僂病活性的一類物質(zhì)，又稱鈣化醇，是類固醇的衍生物，是一類關(guān)系鈣、磷代謝的活性物質(zhì)。具有維生素D活性的化合物約有10種，其中最重要的是維生素D2、維生素D3及其維生素D原。維生素D2無天然存在，維生素D3只存在于某些動(dòng)物性食物中。但它們都可由維生素D原(麥角固醇和7一脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線照射形成。 維生素D2 藥片吃多了中毒。,分析方法中較好的是比色法和高效液相色譜法。,(一)三氯化

26、銻比色法 (二) 高效液相色譜法 它的靈敏度較比色法高30倍以上，且操作 簡(jiǎn)便，精度高，分析速度快。是目前分析維生素D的最好方法。,三氯化銻比色法原理 在三氯甲烷溶液中，維生素D與三氯化銻結(jié)合生成一種黃色化合物，呈色強(qiáng)度與維生素D含量呈正比。食品中維生素D含量較低，其他維生素嚴(yán)重干擾其測(cè)定，因此測(cè)定前必須經(jīng)柱層析除去干擾成分。層析介質(zhì)為硅藻土、中性氧化鋁,說明,1，食品中維生素D的含量一般很低，而維

27、生素A、維生素E、膽固醇、甾醇等成分的含量往往大大超過維生素Ｄ的含量，嚴(yán)重干擾維生素Ｄ的測(cè)定，因此測(cè)定前必須經(jīng)柱層析除去這些干擾成分。２，此法不能區(qū)分維生素Ｄ2和維生素Ｄ3，測(cè)定值為兩者的總量。,第三節(jié)  水溶性維生素的測(cè)定,水溶性維生素包括： 維生素B1(硫胺素) 維生素B2（核黃素）

28、 維生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺） 維生素PP（煙酸） 葉酸、泛酸（維生素B3） 生物素（維生素B7） 維生素C 等，,,,特點(diǎn)： 水溶性維生素都易溶于水, 不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。 在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，即使加熱也不破壞； 但

29、在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，特別在堿性條件下加熱，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響 。,廣泛存在于動(dòng)植物組織中，在食物中常以輔酶的多種形式存在，滿足組織需要后，多余的量都能從機(jī)體排出。,維生素B2對(duì)光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素C對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。,根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定水溶性維生素時(shí)，一般都在酸性溶液中進(jìn)行前處理。,維生素Bl、B2 鹽酸水解

30、 酶解 提取 純化 維生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對(duì)維生素C的破壞作用。草酸價(jià)廉，使用方便，對(duì)維生素C有很好的穩(wěn)定作用。,,,,一、維生素B1的測(cè)定,維生素B1又名硫胺素、抗神經(jīng)炎素，通常以游離態(tài)，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麥胚

31、、花生、黃豆以及綠色蔬菜和牛乳、蛋黃中含量較為豐富。 分析方法：GB/T 5009.84－2003中唯一的方法是熒光計(jì)法。,熒光法原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中，被氧化成一種蘭色熒光物質(zhì)，即為硫色素，在給定的條件下，以及沒有其他物質(zhì)干擾時(shí)，此熒光強(qiáng)度與硫色素含量成正比。 熒光測(cè)定條件： 激發(fā)波長(zhǎng) 365nm；狹縫 5nm. 發(fā)射波長(zhǎng) 435nm；狹縫 5nm.,一、維生素B1的測(cè)定,維生素B 2

32、的測(cè)定,維生素B2即核黃素。在食品中以游離形式或磷酸酯等結(jié)合形式存在。膳食中的主要來源是各種動(dòng)物性食品，其中以肝、腎、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆類和新鮮綠葉蔬菜。 分析方法：GB/T 5009.85—2003中第一法為熒光法。第二法為微生物法。,原理 核黃素在440~500nm波長(zhǎng)光照射下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中，熒光強(qiáng)度與核黃素濃度成正比。在波長(zhǎng)525nm下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。試液再加入

33、低亞硫酸鈉(連二亞硫酸鈉 Na2S2O4),將核黃素還原成無熒光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。,維生素B 6的測(cè)定——微生物法,原理：微生物的生長(zhǎng)與它們對(duì)某些特定的維生素的需求有關(guān)，因此在維生素分析中，將某些微生物在含維生素的樣品抽提液中的生長(zhǎng)速率，與在含已知量維生素對(duì)照溶液中的生長(zhǎng)速率進(jìn)行對(duì)比，從而得出樣品中該維生素的含量。生長(zhǎng)速率可通過測(cè)定濁度、產(chǎn)酸量、質(zhì)量變化或

34、呼吸作用，測(cè)定濁度是最常用的方法。維生素B6的含量在2ng/mL以內(nèi)，其濃度對(duì)卡爾斯伯酵母菌的生長(zhǎng)速率有良好的線性關(guān)系，可以定量測(cè)定。,二、維生素C的測(cè)定,維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤為豐富。,,,,,氧化,,氧化,還原型抗壞血酸 脫氫抗壞血酸

35、 2，3－二酮古樂糖酸,三、維生素C的測(cè)定,維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3 -二酮古樂糖酸，失去生理作用。食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括2，3 -二酮古樂糖酸和進(jìn)一步的氧化產(chǎn)物。,VC檢測(cè)技術(shù)2，6-二氯靛酚滴定法簡(jiǎn)便/須脫色、干擾多（深色、其他還原性物質(zhì)）二甲苯－二氯靛酚比色法 深

36、色熒光法：準(zhǔn)確度高，較復(fù)雜2,4-二硝基苯肼法,,還原型VC的測(cè)定,,總VC的測(cè)定,總VC=氧化型VC+還原型VC+二酮古樂糖酸,,少,,氧化+還原+二酮古樂糖酸,操作復(fù)雜，結(jié)果易受影響,氧化型+還原型,,1．原理 還原型抗壞血酸可以還原染料2，6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色(在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色)，被還原后顏色消失?！　∵€原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品

37、提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗杯血酸含量成正比。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc*,還原型Vc 染料（顯色） 氧化型Vc 被還原的染料（不顯色）,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,2. 試劑2%草酸溶液：稱20g草酸，加水至1000mL；維生素C標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱20mgVC溶于1%草酸中，并稀釋至100mL，吸5mL于50ml容量瓶中，加入1%草

38、酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；0.02%2，6-二氯靛酚溶液：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后，稀釋至250mL，過濾于棕色瓶中，貯存于冰箱內(nèi)，應(yīng)用過程中每星期標(biāo)定一次。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,④ 0.001N KIO3標(biāo)液：吸0.1N KIO3溶液5ml→于500ml容量瓶?jī)?nèi)→加水至刻度，每毫升相當(dāng)VC 0.008mg⑤ 0.5%淀粉溶液；⑥

39、 6%KI溶液。,標(biāo)定一：吸標(biāo)液（VC）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→ →加2%草酸溶液10ml → 加1%淀粉3滴→用KIO3標(biāo)液滴定到淡蘭色。計(jì)算： 抗壞血酸濃度（mg/ml）=c V1 × 88/ V2 c- KIO3標(biāo)液的濃度（mol/L）V1 - 滴定時(shí)消耗KIO3標(biāo)液的體積（ml）V2 -維生素C溶液量,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,標(biāo)定二：吸5ml已知濃度V C標(biāo)液 → 加5ml1

40、%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉紅色，在15秒不褪色為終點(diǎn)計(jì)算：每毫升2，6-二氯靛酚相當(dāng)于維生素C的毫克數(shù)等于滴定度（T） T= （C × V1）/  V2C - 維生素C的濃度（mg/ml）V1 -維生素C的體積（ml）V2 -消耗2，6-二氯靛酚的體積（ml）,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,測(cè)定過程A. 樣品處理新鮮果

41、蔬樣品：稱取鮮樣50.0～100.0g，放入組織搗碎機(jī)的杯中加入等重量的2%草酸提取液，快速搗碎1分鐘，將樣品打成漿狀。樣品處理的整個(gè)過程應(yīng)在10分鐘內(nèi)完成，以免VC被空氣氧化。 用小燒杯稱取漿狀物10.0～30.0 g（含還原性VC 1～5 mg），放入100mL容量瓶中，用2%草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。 過濾，如果濾液顏色深，影響滴定終點(diǎn)的判定時(shí)，可加入1～2勺白陶土脫色，不易過濾，可用離心機(jī)分離。

42、,多汁果蔬樣品：可用紗布?jí)褐竺撝藁焖龠^濾，量取10～20mL汁液，立即用2%草酸溶液定容至100mL容量瓶中干樣品：稱取1.000～4.000 g（含還原性Vc 1～5mg），放入研缽中，加入少許2%草酸溶液研磨成漿狀液，洗入100mL容量瓶中，用20g/L草酸溶液定容。含有還原性物質(zhì)的樣品：含有較多Fe2+的樣品可用8% 醋酸代替用2%草酸溶液作為浸提劑。亞硫化脫水樣品，可于稀釋至一定容量之前加入20mL丙酮，

43、以除去SO2的干擾。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,B 滴定：吸取以上制備的無色濾液5.00～10mL（含Vc約0.2～1mg）放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中裝的2，6-二氯靛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淺紅色，約在15秒內(nèi)不褪色為終點(diǎn), 同時(shí)以浸提劑作為空白（空白值為0.08～0.10 mL）進(jìn)行滴定。計(jì)算： Vc（mg/100g )=(V－V0) ×T/m×100式中：x－樣品中還原型

44、抗壞血酸含量，mg/100g；V－滴定時(shí)樣液消耗染料的體積，mL；V0－空白滴定時(shí)消耗染料的體積，mL；T－用標(biāo)準(zhǔn)還原型抗壞血酸溶液標(biāo)定染料溶液所得出1mL 染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量，mg/mL；m－滴定時(shí)所取濾液中含有樣品的質(zhì)量，g,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,注意事項(xiàng):⑴ 所有試劑的配制最好都用重蒸餾水；⑵ 滴定時(shí)，可同時(shí)吸二個(gè)樣品。一個(gè)滴定，另一個(gè)作為觀察顏色變化的參考；⑶樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)浸泡在

45、已知量的2%草酸液中，以防氧化，損失維生素C；2%草酸有抑制抗壞血酸氧化酶的作用，而1%草酸無此作用；⑷貯存過久的罐頭食品，可能含有大量的低鐵離子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。這時(shí)如用草酸，低鐵離子可以還原2，6-二氯靛酚，使測(cè)定數(shù)字增高，使用醋酸可以避免這種情況的發(fā)生；,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,⑸ 整個(gè)操作過程中要迅速，避免還原型抗壞血酸被氧化；滴定開始時(shí)，染料溶液應(yīng)迅速加入直至紅色不立即消失

46、，而后盡可能一滴一滴地加入，并不斷搖動(dòng)三角瓶，至粉紅色15s 內(nèi)不消失為止。樣品中某些雜質(zhì)還可以還原染料，但速度較慢，故滴定終點(diǎn)以出現(xiàn)紅色15s 不褪色為終點(diǎn)。滴定時(shí)，可同時(shí)吸二個(gè)樣品。一個(gè)滴定，另一個(gè)作為觀察顏色變化的參考 ⑹ 在處理各種樣品時(shí)，如遇有泡沫產(chǎn)生，可加入數(shù)滴辛醇消除； ⑺ 測(cè)定樣液時(shí)，需做空白對(duì)照，樣液滴定體積扣除空白體積。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法—還原性Vc,(二)熒光法（GB/T 5009.86-200

47、3 第一法）原理 樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化生成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉。在一定條件下，喹喔啉的熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度成正比，以此測(cè)定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。一定條件：激發(fā)光：338nm 發(fā)射光：420nm,,（三）2，4-二硝基苯肼法---- Vc總量GB/T 5009.86—2003 《蔬菜、水果及其制品中總抗

48、壞血酸含量測(cè)定方法》第二法,總抗壞血酸包括： 還原型 脫氫型 二酮古樂糖酸型。 此法是將樣品的還原型抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，然后與2，4-二硝基苯肼作用，生成紅色的脎。脎的量與總抗壞血酸含量成正比，將紅色脎溶于硫酸后進(jìn)行比色，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總Vc。,,1、原理：樣品中還原型的抗壞血酸經(jīng)活性碳氧化為脫氫型抗壞血酸，再與2，4－二硝基苯肼

49、作用，生成紅色的脎，其呈色強(qiáng)度與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色測(cè)定。,（三）2，4-二硝基苯肼法 ---- Vc總量,（三）2，4-二硝基苯肼法 ---- Vc總量,2、測(cè)定步驟(1) 樣品提取 同2，6-二氯靛酚滴定法(2) 氧化處理：取25mL樣品濾液 + 2g活性炭 振搖1min →過濾→收集濾液 + 2% 硫脲10mL(目的：防止Vc繼續(xù)氧化)(3)顯色反應(yīng): ①取三支試管，每支試管都加入上述氧化稀釋液4mL。其中一

50、支試管作空白，另兩只試管各加入1.0mL2％2，4－二硝基苯肼溶液，將三支試管放入（37±0.5）℃恒溫箱或水浴中準(zhǔn)確保溫3h。取出試管放入冰水中。,②空白管冷至室溫后加入0.1mL2％2，4－二硝基苯肼溶液，10～15min 后也放入冰水中。③向每支試管滴加 5mL85％硫酸，邊加邊搖動(dòng)，滴加時(shí)間至少需要1min。加完硫酸后將試管從冰水中取出，室溫下準(zhǔn)確放置30min 后立即比色。,（三）2，4-二硝基苯肼法 ----