第三章dna的復制

1、第三章 DNA的復制,第一節(jié)半保留復制的驗證 半保留模型（semioconservetive model） 全保留復制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。,驗證半保留復制的實驗,一、Meselson-Stahl實驗 二、Taylar實驗 三、姐妹染色單體差別染色方法（sister- chromatid differential s

2、taining） 5溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，簡稱BUdR） 斑色染色體（Harlequin chromosome） 四、Cairns復制模型—θ型復制,圖11-4 Taylor 蠶豆根尖放射自顯影實驗。(a)按半保留復制預期DNA在復制過程中標記情況；(b)實驗結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。,,第二節(jié)復制的起點、方向和終點,一. 研究方法： 1. 用同位素標記電

3、鏡觀察及變性法2. 用噬菌體插入標記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法（denaturation mapping） 4. 雙向電泳法,圖11-11不同步培養(yǎng)時各標記的拷貝數(shù)不同 復制起點標記的拷貝數(shù)應(yīng)最多,二、原核的復制起點和方向,E.coli定點、雙向?qū)ΨQ復制。 T7在近一端的17％處開始，向兩端延伸。 枯草桿菌有固定的起始點，雙向不對稱復制。 質(zhì)粒R6K早期為

4、單向復制，復制了約1/5基因組 進行時雙向復制。 質(zhì)粒Col E1有固定起始點，但卻為單向復制。 mt DNA進行D（displaced loop）環(huán)復制  真核有多個復制起點（i），雙向等速復制。,D環(huán)復制,第三節(jié)DNA復制突變型的篩選,根據(jù)溫度敏感性篩選同位素標記法篩選5－溴尿嘧啶摻入法質(zhì)粒溫度敏感性的篩選根據(jù)抗藥性篩選根據(jù)與突變有關(guān)的生物學功能篩選快停突變與慢停突變

5、,,,第四節(jié)原核生物復制的酶系統(tǒng),DNA合成酶DNA聚合酶的共同特點是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'－OH； （3）合成的方向都是5’→3’; （4）除聚合DNA外還有其它功能。,表11-1 E.coli 中的三種DNA多聚酶,,,(一). DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu),DNA聚合酶有6個結(jié)合位點：(1) 模板結(jié)合位點；(2) 引物結(jié)合位點；

6、(3) 引物3’－OH結(jié)合位點；(4) 底物dNTP結(jié)合位點；(5) 5’→3’外切酶結(jié)合位點；(6) 3’→5’校正位點。,,(二). DNA聚合酶Ⅰ的功能,1. 5’→3’聚合功能 2. 3’→5’外切活性 3. 5’→3’外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)鏈的置換； (3)模板轉(zhuǎn)換（template-swi

7、tching） 4. 內(nèi)切酶活性,,(三)DNA多聚酶Ⅲ的結(jié)構(gòu),,全酶在DNA上的裝配分為三個階段：,（1）一個β二聚體加上一個γ復合體識別引物模板形成一種前起始復合物。（2）DNA在于β,γ復合體結(jié)合的位點構(gòu)象發(fā)生改變，而對核心酶產(chǎn)生了高親和。使核心酶能與DNA結(jié)合。（3）τ二聚體結(jié)合核心聚合酶，使其二聚化。,二. DNA連接酶,其作用機制是分三步進行：1. 在真核生物中， E＋ATP→E－AMP＋ppi 在E

8、.coli中， E＋NAD→E－AMP＋NMN（煙酰胺單核苷酸）2. E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’-PO4上使其活化3. 活化的5’－PO4與相鄰的3’－OH作用形成 3’－5’磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。,三. 單鏈結(jié)合蛋白（SSB）,又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helix destabilizing protein）由177個aa組成在E.coli 中以四聚存在分子量為74KDa在原核中SSB與

9、DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個SSB和DNA的結(jié)合改變了DNA的結(jié)構(gòu)。,四.解旋酶(helicase),第五節(jié) 原核生物，噬菌體和病毒的復制起始和終止,一.環(huán)狀DNA的復制,復制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點是：,（1）富含A－T，這可能和雙鏈易于解開起始 復制有關(guān)；（2）含有多個回文結(jié)構(gòu)（9－14個GATC） 8個GATC較保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3

10、）具有 4個反向重復順序，作為蛋白結(jié)合 位點；（4）此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個啟動子，其可能的作用是：①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物；②產(chǎn)生復制必要的蛋白；③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RNA；④起轉(zhuǎn)錄激活作用。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

11、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1968年Gilbert提出滾環(huán)復制模型:,（1）共價延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈 分開;（3）不需RNA引物，在正 鏈3‘－OH上延伸（4）只有一個復制叉;（5）形成多聯(lián)體（concatemer ）;,,,滾環(huán)復制的電鏡照片,哪些DNA進行滾環(huán)復制?,真核rDNA的擴增；F因子DNA的轉(zhuǎn)移；λ裂解途經(jīng)的復制； φX174,M13.G4等；

12、單鏈環(huán)狀DNA噬菌體第二階段復制都是進行滾環(huán)復制的。,二.DNA末端起始復制,線性雙鏈DNA的復制有的是從一端開始的: 腺病毒（Adenovirus） φ29 DNAs 脊髓灰質(zhì)病毒（poliovirus)腺病毒DNA全長35937 bp，線性雙鏈，兩端各有反向重復順序103～162 bp，兩末端各有50 bp為復制起點。其復制是以單鏈置換（strand displacement）形成一個大的莖環(huán)

13、或叫平鍋形結(jié)構(gòu)來進行的。,三.復制的終止,E.coli的復制終止現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個終止區(qū)域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇點的另一側(cè)100Kb處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿拥膹椭撇鎭碚f是特異的。ter順序有一個23bp的區(qū)域，在體外可導致復制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要tus(terminus utilization substance)基因的產(chǎn)物Tus(36kD)，Tus能識別ter保守順序，并阻止復制

14、叉繼續(xù)前進。ter-Tus復合物可能通過抑制螺旋酶來實行終止。,,,,第六節(jié) 復制的過程,一.半不連續(xù)復制,E.colidUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點切出一個缺

15、口，進一步進行切除修復。,以下實驗證實了這個解釋：,(1)在dut -突變體（dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut +中為短。這是因為U摻入機會增加；(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現(xiàn)AP位點，所以堿沉淀時不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。 在dut-, ung-雙突變體中，結(jié)果和實驗（2）相同，更進一步

16、證實了此推測。,,,,,,酵母的自主復制區(qū),ARS(autonomously replicationg sequence)發(fā)揮復制起點的功能，但是過量的；酵母染色體Ⅳ的著絲粒附近為ARS1序列；ARS1分為A,B,C三個功能區(qū), A,B起主要作用,C起次要作用；A區(qū)為15bp,其中11個保守，稱ACS (ARS consensus sequence)。有復制起始子的功能；B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個功能區(qū)；B3是

17、ABF1（ARS-binding factor 1）結(jié)合區(qū)。,酵母的復制,,ORC：由6個亞基組成相當于DnaA和λ的O蛋白，與 A/B1結(jié)合，結(jié)合于游離的DNA Cdc6:相當于DnaC,及λ的P蛋白，使Mcm蛋白結(jié)合到復合體上。此對在Origin上起始復制是必須的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合于B3,,原核和真核生物復制體系的比較,E.coli λ

18、 SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶 DnaC

19、 P ? Cdc6 裝配因子 DnaG DnaG Polα-引發(fā)酶 Polα-引發(fā)酶 引發(fā)酶 PolⅢ的 α亞基 Polδ Polδ,Polε 聚合酶 PolⅢ的ε亞基

20、 Polδ Polδ,Polε 校正 PolⅢ的?亞基 PCNA PCNA 滑動鉗 ? 復合體 RF-C RF-C 滑動鉗裝配器 SSB RF-A RF-A 單鏈結(jié)合蛋白,,,,Pvu Bg1 Bam H1 Ba

21、m pBR322 TEL TEL 四膜蟲rDNA ARS Pvu Bg1

22、 Bam H 連接 Pvu 轉(zhuǎn)化酵母

23、 Pvu 傳幾代酵母DNA Pvu Pvu

24、 連接 轉(zhuǎn)化酵母 傳幾代 圖 11-56 四膜蟲與酵母TEL的拼接以及酵母細胞將其特有的TEL加到四膜蟲

25、 的TEL上(參考Shampg,J and Blackburn et al: 《Nature》1984,310:154-157),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,真核生物與原核生物DNA合成的區(qū)別,真核DNA復制和原核DNA復制的區(qū)別,1、 真核DNA復制為多個復制起點。

26、2 、真核DNA復制時DNA聚合酶有五種（α、β、γ、δ和ε），其中只有δ酶具有3′→5′外切酶活性；而原核生物只有三種DNA聚合酶（polⅠ、Ⅱ、Ⅲ），且都具有3′→5′外切酶活性。真核的polδ和α分別負責合成前導鏈和后滯鏈，而原核的polⅢ是兩者兼顧。3、真核細胞內(nèi)DNA引物酶和polα緊密偶聯(lián)，而在原核細胞內(nèi)引發(fā)酶是和解旋酶偶聯(lián)在一起，形成復制體的一部分。,,作業(yè)：1、圖示說明DNA半保留復制的機制證明。2、DNA復制