現(xiàn)代生物技術(shù)與應用

1、1,生物技術(shù)與醫(yī)藥Biotechnology and Medicine,王鳳山Wang Feng-shan山東大學藥學院生化與生物技術(shù)藥物研究所,2,第一節(jié) 生物技術(shù)一、生物技術(shù)的定義(Definition of Biotechnology),3,生物技術(shù)與其他學科的關(guān)系The relationship of biotechnology and other subjects,4,二、生物技術(shù)的發(fā)展The histor

2、y of biotechnology,（一）傳統(tǒng)生物技術(shù)1000多年以前人們就開始應用生物技術(shù)公元前6000年前，蘇米爾人即古代巴比倫人就已會釀造啤酒公元前5000年~公元前4000年（即仰韶時期）我國的先人在就利用小口尖底甕保溫發(fā)酵釀制谷芽酒 我國的醬油距今已有3000年的歷史1857年巴斯德證明發(fā)酵是由于微生物的作用1917年匈牙利工程師Karl Ereky提出生物技術(shù)這個詞,5,二、生物技術(shù)的發(fā)展The histor

3、y of biotechnology,（二）近代生物技術(shù) 1928年Fleming發(fā)現(xiàn)了青霉素20世紀40年代抗生素工業(yè)成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)20世紀50年代氨基酸發(fā)酵工業(yè)出現(xiàn)20世紀60年代酶制劑工業(yè)開始形成規(guī)模20世紀70年代出現(xiàn)了以基因克隆為代表的現(xiàn)代生物技術(shù) 近代生物技術(shù)的特征是微生物發(fā)酵技術(shù),6,傳統(tǒng)與近代生物技術(shù)的主要步驟,7,傳統(tǒng)與近代生物技術(shù)的主要研究內(nèi)容,菌種的篩選與誘變適合菌種生長的

4、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件生物反應器的設(shè)計與制造發(fā)酵產(chǎn)物的純化,8,（三）傳統(tǒng)與近代生物技術(shù)的局限性,提高產(chǎn)量的幅度非常有限傳統(tǒng)的誘變和選擇的方法過程煩瑣、耗時長、費用高、篩選克隆多只能提高微生物一種已有的遺傳性質(zhì)，不能賦予這種微生物其他遺傳特性,9,（四）現(xiàn)代生物技術(shù) 1. 現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn) The emerge of modern biotechnology,1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，奠定了

5、現(xiàn)代分子生物學的基礎(chǔ)1973年美國加利福尼亞大學舊金山分校的Herbert Boyer 教授和斯坦福大學的Stanley Cohen教授共同完成的基因工程實驗為標志,10,Boyer and Cohen,11,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Double helix structure of DNA,12,Boyer and Cohen 的策略,13,2.現(xiàn)代現(xiàn)代生物技術(shù)的主要研究內(nèi)容The content of modern biotechn

6、ology,基因工程(Genetic engineering)細胞工程(Cell engineering)酶工程(Enzyme engineering)發(fā)酵工程(Fermentation engineering)蛋白質(zhì)工程、抗體工程、糖鏈工程、生物轉(zhuǎn)化 等,14,（1）基因工程 Genetic engineering,基因工程又叫遺傳工程，是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心和主導。 所謂遺傳工程就是從生物體中把生物遺傳物質(zhì)（

7、基因或DNA分子）分離出來，或人工合成一段基因，用人工的方法對遺傳物質(zhì)進行搭配、組合，然后轉(zhuǎn)入某生物的細胞內(nèi)，從而通過改變其遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)來改變它的遺傳特性，使它定向地產(chǎn)生所需的生物品種。 由于它在DNA分子水平上動手術(shù)，又稱為DNA重組技術(shù)、分子水平雜交技術(shù)或稱基因操作。,15,基因克隆示意圖,16,基因工程 Genetic engineering,基因工程可以跨越生物遠緣不能雜交的鴻溝，實現(xiàn)物種，甚至動物、植物、微

8、生物之間的基因雜交，所獲得的生物產(chǎn)品或生物新品種在醫(yī)藥、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和環(huán)境保護具有廣闊的應用前景。,17,（2）細胞工程 Cell engineering,細胞工程是指將一種生物細胞中攜帶的全套的遺傳信息的基因或染色體整個地轉(zhuǎn)入另一種生物細胞，從而改變其細胞的遺傳特性，改造了生物的性狀與功能，從而創(chuàng)造了新的生物類型。 由于細胞工程是在細胞水平上動手術(shù)，又可稱為細胞操作技術(shù)。,18,細胞工程的內(nèi)容The cont

9、ent of cell engineering,細胞培養(yǎng)（cell culture)細胞融合(cell fusion)細胞重組（cell recombination）雜交瘤技術(shù)（單克隆抗體）(hybridoma technique)原生質(zhì)體融合技術(shù)(protoplast fusion technology)組織培養(yǎng)技術(shù)( tissue culture technology),19,細胞培養(yǎng)（Cell culture),指將動物

10、、植物或微生物的細胞或組織經(jīng)無菌處理后置于人工培養(yǎng)基上，使細胞增殖，進而按需要培養(yǎng)的技術(shù)。,20,細胞融合技術(shù) Cell fusion technology,細胞融合技術(shù)是將兩個不同種類的細胞，通過化學的、生物的或物理的辦法，使它們彼此融合在一起，從而產(chǎn)生出兼有兩個親體的遺傳性狀的細胞。這實質(zhì)上是無性雜交，故又稱其為體細胞雜交。,21,細胞重組（cell recombination）,指在體外條件下，運用一定的實驗技術(shù)從活細胞中分離

11、出各種細胞的結(jié)構(gòu)或組成部件，再把它們在不同的細胞之間重新進行裝配，成為具有生物活性的細胞，主要有核移植、葉綠體移植、核糖體重建和線粒體裝配等技術(shù)。世界上第一例經(jīng)體細胞核移植成功的動物—多莉的培育過程如圖。,22,雜交瘤技術(shù)（單克隆抗體）(hybridoma technique),是指將產(chǎn)生抗體的細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化，使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系，由于這種雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體是針對一個

12、抗原決定簇的抗體，又是單一的淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，故又稱為單克隆抗體，,23,24,組織培養(yǎng)技術(shù) Tissue culture technology,人或動物的組織培養(yǎng)植物的組織培養(yǎng),2001年2月26日，在北京展覽館'國家863科技成果展'上一只長'人耳'的老鼠正與公眾見面。'裸鼠'由上海組織工程研究與開發(fā)中心成功培育，"體外再生耳廓形狀軟骨"(俗稱"體外

13、再生耳朵")意味著"耳朵"不僅可以大規(guī)模生產(chǎn)，也可直接移植到病人身上。,25,（3）發(fā)酵工程 Fermentation engineering,發(fā)酵工程是通過現(xiàn)代技術(shù)手段，利用微生物的特殊功能生產(chǎn)有用的物質(zhì)，或直接將微生物應用于工業(yè)生產(chǎn)的一種技術(shù)體系。這項技術(shù)主要包括菌種選育、菌種生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，以及微生物機能的利用等技術(shù)。 發(fā)酵工程已用于多種產(chǎn)品如酒類、抗生素、氨基酸、微生素、激

14、素、工業(yè)用酶等生產(chǎn)。近年來，隨著基因工程、細胞工程和酶工程技術(shù)向發(fā)酵工程的滲透，更拓寬了它的應用領(lǐng)域。,26,發(fā)酵工程的具體過程示意圖,27,（4）酶工程 Enzyme engineering,酶工程是利用酶的催化特性，通過化工技術(shù)進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的工程技術(shù)。 它主要包括酶的開發(fā)和生產(chǎn)、酶的分離和純化、酶的固定化、反應器的研制及酶的應用等內(nèi)容。,28,29,（5）蛋白質(zhì)工程 Protein engineering,蛋白質(zhì)

15、工程是一門從改變基因入手，制造新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。 其過程是：先找到一個合成與這種新型蛋白質(zhì)的基因接近的基因；然后，修改這個基因（用定位突變技術(shù)修改這個基因的核酸順序）；再把修飾好的基因植入細菌或生物的細胞里，讓細菌產(chǎn)生出人們想要的新型蛋白質(zhì)。,30,用基因的點突變技術(shù)改變IFN-?的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,31,它與基因工程的區(qū)別在于，前者是利用基因拼接技術(shù)用生物生產(chǎn)已存在的蛋白質(zhì)，后者則是通過改變基因順序來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，生

16、產(chǎn)新的蛋白質(zhì)。 因此，蛋白質(zhì)工程又被稱為第二代基因工程，也被稱為第二代生物技術(shù)。,32,第二節(jié) 生物技術(shù)與藥物研究一、生物技術(shù)與藥物發(fā)現(xiàn),生物技術(shù)是藥物發(fā)現(xiàn)的重要技術(shù)手段，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展深刻地影響著藥物發(fā)現(xiàn)的策略與研究模式，使得藥物的發(fā)現(xiàn)取得了快速進展并獲得了突破性的成果：一方面，基因組學、蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等新興學科的崛起和發(fā)展為藥物的發(fā)現(xiàn)提供了更為廣泛而深刻的理論基礎(chǔ)；另一方面，計算機輔助藥物設(shè)計、分子對

17、接和虛擬篩選、高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展和完善，為藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的技術(shù)手段和有力工具，極大地拓寬了藥物發(fā)現(xiàn)的途徑。,33,（一）現(xiàn)代組學與藥物發(fā)現(xiàn)1．基因組學（genomics）,基因組學是研究基因組的結(jié)構(gòu)、功能及表達產(chǎn)物的學科，包括三個不同的亞領(lǐng)域，即結(jié)構(gòu)基因組學、功能基因組學和比較基因組學。人類基因組計劃的實施和完成提供了更多基因變異與藥物個體效應差異之間的關(guān)聯(lián)證據(jù)，為從基因水平研究藥物反映的個體差異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。因此

18、，近年來在藥物研究中提出了基因組藥物學（或稱基因組藥理學，pharmacogenomics）的新概念，為新型藥物的研究創(chuàng)造了新的契機。未來的藥物不僅要以所治療疾病的類型作為研究的基礎(chǔ)，同時將全面考慮患者的病理特點，包括患者個體的基因特點、代謝特點和功能變化特點，使藥物的應用真正實現(xiàn)“量體裁衣”，達到最佳的個體化治療效果。,34,2．蛋白質(zhì)組學（proteomics）,蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，只有完全注釋基因組序列所編碼的蛋白功能，

19、才能真正實現(xiàn)基因組研究的價值。蛋白質(zhì)組學是闡明生物體各種生物基因組在細胞中表達的全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式的學科，包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式（修飾形式）、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。,35,蛋白質(zhì)組學可以全面檢測疾病發(fā)生與發(fā)展過程中以及藥物干預過程中蛋白質(zhì)表達譜和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的變化，從而發(fā)現(xiàn)影響疾病或藥物作用的關(guān)鍵的具有特異功能的蛋白質(zhì)，并對這些蛋白進行一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)測定，綜合分析其生物學功能，推測新的、潛在的藥物作

20、用靶標。 蛋白質(zhì)組學的研究也能促進人們根據(jù)功能蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律合理設(shè)計藥物或?qū)ζ溥M行結(jié)構(gòu)改造，從而產(chǎn)生新的藥物。因此，蛋白質(zhì)組學是基因組和藥物發(fā)現(xiàn)的橋梁和紐帶。,36,3．轉(zhuǎn)錄組學（transcriptomics）,轉(zhuǎn)錄組學是一門在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況。轉(zhuǎn)錄組學通過分析轉(zhuǎn)錄譜中的共調(diào)節(jié)基因，闡明基因選擇性表達所依賴的復雜調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)，提

21、示基因組中與某一生命現(xiàn)象或病理狀態(tài)相關(guān)的基因；基于這些信號網(wǎng)絡(luò)尋找和發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因的未知生物學功能，提示藥物潛在的作用靶點及其發(fā)揮作用的分子機制。轉(zhuǎn)錄組學研究在指導新藥設(shè)計與合成、新藥篩選等藥物發(fā)現(xiàn)過程中也具有重要的應用價值。,37,4．代謝組學（metabonomics）,代謝組學以生物體液(包括尿液、血液、汗液、膽汁、腦脊液等)、細胞提取物以及組織提取物為主要研究對象，通過動態(tài)評價機體生物液體中內(nèi)源性和/或外源性代謝產(chǎn)物的濃度與功

22、能，即代謝產(chǎn)物譜的變化，來研究評價藥物對機體產(chǎn)生的生物學作用及機體對藥物的代謝途徑、代謝特點等。,38,代謝產(chǎn)物是機體繼基因激活、轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等一系列生命活動之后的最終信號載體之一。因此，代謝組學研究有可能更為準確而全面地揭示藥物對機體所產(chǎn)生的生物學效應以及機體對藥物的作用。代謝組學為基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究的有力補充。代謝組學技術(shù)還可以廣泛地參與藥物的早期藥理學活性及毒性篩選、先導化合物的選擇與優(yōu)化以及藥物的臨床前

23、安全性評價。,39,（二）與藥物發(fā)現(xiàn)密切相關(guān)的生物新技術(shù),1．生物芯片技術(shù) （biochip, microarray）生物芯片技術(shù)是指通過在微小基片（硅片或玻璃）表面固定大量的分子識別探針，或構(gòu)建微分析單元或檢測系統(tǒng)，對標記化合物、核酸、蛋白質(zhì)、細胞或其他生物組分進行準確、規(guī)?；目焖俸Y選或檢測。目前，生物芯片主要包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片等。,40,41,2．表面等離子共振技術(shù)（ surface plasmon

24、resonance, SPR）,表面等離子共振技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種以芯片為基礎(chǔ)的光學生物傳感器系統(tǒng)，它不需要熒光或放射性標記物，分子結(jié)合與分離時可產(chǎn)生光強度變化。分子結(jié)合到一個固相化的生物靶分子上，當分析物溶液通過傳感器芯片時，結(jié)合到靶分子上的分子可被即時檢測。,42,3．轉(zhuǎn)基因技術(shù) （transgene technology）,轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常包括基因敲入和基因敲除兩種方式。其顯著特點是：分子及細胞水平操作，組織及動物整體水平

25、表達。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為研究藥物對機體整體的作用提供了很好的技術(shù)手段，在藥物發(fā)現(xiàn)過程中其主要應用價值體現(xiàn)在以下幾個方面。,43,從分子水平上去研究和認識疾病To study and understand diseases on molecular level,在過去，有許多的疾病如遺傳性疾病、癌癥等，由于對其發(fā)病機理認識不清，醫(yī)學工作者對這些疾病的治療只能采取用藥治療的方法，難以根治，多年來一直視為不治之癥，顯得人們在這些疾病面前束

26、手無策。 現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)生以后，使人們能夠從基因的水平上對這些疾病進行研究，找到了發(fā)病機理，在研究治療手段時就能有的放矢。,44,建立基于特殊疾病的整體動物模型，實現(xiàn)藥物的體內(nèi)活性篩選 藥物作用靶標的鑒定和確認：基因組、蛋白質(zhì)組以及生物芯片等主要從細胞和分子水平尋找和發(fā)現(xiàn)藥物的作用靶標；而轉(zhuǎn)基因動物能夠模擬人體的內(nèi)環(huán)境，從而能更準確地實現(xiàn)對藥物作用靶標的鑒定和確認。藥代動力學及藥物臨床前評價：特定的轉(zhuǎn)基因動物能夠幫助

27、研究人員在藥物發(fā)現(xiàn)過程中盡早地了解藥物的代謝特征及其毒理學特點，從而決定是否繼續(xù)開展或終止藥物的后續(xù)開發(fā)活動。目前，轉(zhuǎn)基因動物被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、心血管疾病等多種疾病治療藥物的相關(guān)研究中。,45,4．RNA干擾技術(shù)（RNA interference, RNAi）,RNAi 是指將與mRNA 對應的正義RNA（sense RNA）和反義RNA（anti-sense RNA）組成的雙鏈RNA （dsRNA）導入細胞誘導靶mRNA發(fā)

28、生特異性的降解而導致基因沉默的現(xiàn)象，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默，,46,5．生物信息學技術(shù) （bioinformatics）,生物信息學是綜合運用數(shù)學、計算機與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)以及生物學等手段對各種生物信息進行收集、加工、儲存、分析、整理和歸納，并對生物信息做出解析的學科。 生物信息學的研究內(nèi)容主要包括：① 建立、貯存并管理大量的生物學信息庫，包括基因組序列、基因多態(tài)性、基因表達調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、特征性代謝產(chǎn)物譜、疾病相關(guān)基因和/或蛋白質(zhì)、生

29、物標志物信息庫等；② 開發(fā)計算機算法和統(tǒng)計學方法，分析確定數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)的相關(guān)性；③ 應用已知的生物學信息預測或分析生物大分子或小分子化合物的結(jié)構(gòu)與功能。生物信息學可應用于藥物發(fā)現(xiàn)的全過程，包括藥物分子設(shè)計、藥物靶點的發(fā)現(xiàn)與確認、藥物篩選以及藥物臨床前評價等。,47,6．組合生物合成技術(shù)（combinatorial biosynthesis）,組合生物合成是以天然復雜結(jié)構(gòu)化合物及具有明確藥理活性的天然小分子化合物為底物，以具有生物催

30、化活性的工業(yè)微生物、植物細胞、分離酶為反應工具，通過一次培養(yǎng)、多次培養(yǎng)轉(zhuǎn)化及酶轉(zhuǎn)化、合成的方式，建立單一或多反應體系，利用催化功能不同的生物催化劑對天然活性先導化合物的不同活性或毒性基團進行不同形式的分子結(jié)構(gòu)修飾和改造，或者是利用底物選擇性比較寬泛的生物催化劑催化多種天然活性先導化合物發(fā)生類似的催化反應，從而快速高效地合成大量結(jié)構(gòu)類似的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從而形成分子結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫。,48,7．高通量篩選技術(shù) （high through

31、put screening，HTS）,高通量藥物篩選是自20世紀后期起發(fā)展起來在傳統(tǒng)的篩選技術(shù)基礎(chǔ)上，應用先進的分子生物學、細胞生物學、計算機、自動化控制等高新技術(shù)，建立的一套適合于藥物篩選的技術(shù)體系。,49,8．高內(nèi)涵篩選技術(shù)（high content screening, HCS）,HCS是指在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，盡可能同時檢測被篩選樣品對細胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導等多個環(huán)節(jié)的影響，涉及的靶點包括細胞

32、的膜受體、胞內(nèi)成分、細胞器和離子通道等，即從單一實驗中獲得大量與候選物藥理學活性相關(guān)的信息及其潛在的毒性作用。,50,9．虛擬篩選技術(shù)（visual screen）,虛擬篩選是指利用計算機強大的計算能力，針對重要疾病治療靶標的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)或定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）模型，采用三維藥效基團模型搜尋或分子對接的方法，從現(xiàn)有化合物數(shù)據(jù)庫中尋找發(fā)現(xiàn)與靶標生物大分子結(jié)合或符合QSAR的化合物。虛擬篩選的目的是從大量化合物中尋找發(fā)現(xiàn)有苗頭的

33、化合物，集中目標，從而減少待篩選化合物的數(shù)量，縮短研究周期，降低研究成本。,51,二、生物技術(shù)與藥物設(shè)計,應用蛋白質(zhì)工程技術(shù)設(shè)計新的藥物應用酶工程改變藥用酶的性質(zhì) 應用抗體工程設(shè)計新型抗體 應用糖鏈工程設(shè)計新型糖蛋白類藥物,52,（一）應用蛋白質(zhì)工程技術(shù)設(shè)計新的藥物New drug design by using protein engineering —用定位突變技術(shù)更換活性蛋白的某些關(guān)鍵氨基酸殘基,例如天然白介素-2的第1

34、25位氨基酸殘基為半胱氨酸，它的存在容易使白介素-2在表達之后兩個白介素-2分子的半胱氨酸殘基形成二硫鍵而形成聚合體，引起活性的降低。將半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，所得的突變白介素-2不會形成二聚體，活性高，熱穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期長。是我國首創(chuàng)的基因工程藥物。,53,（一）應用蛋白質(zhì)工程技術(shù)設(shè)計新的藥物 New drug design by using protein engineering —增加、刪除或調(diào)整分子上的某些肽段,改變蛋白質(zhì)

35、分子上的某些肽段，可改變其生物活性，產(chǎn)生新的生物功能。如將大腸桿菌表達的tPA的A鏈F、G、K1 3個結(jié)構(gòu)域除去，只留下A鏈的K2結(jié)構(gòu)域和B鏈，從而失去肝細胞識別的A鏈非糖鏈的依賴結(jié)構(gòu)，結(jié)果半衰期從5~6分鐘上升到11.6~15.4分鐘。,54,（一）應用蛋白質(zhì)工程技術(shù)設(shè)計新的藥物 New drug design by using protein engineering —將功能互補的兩種基因工程藥物在基因水平上融合,通過基因融合而

36、獲得的嵌合型藥物，其功能不僅僅是原有藥物功能的加和，還會出現(xiàn)新的藥理作用。如白介素-6與白介素-2融合表達產(chǎn)物CH925除具有兩者的活性外，還可提高不同級別紅細胞祖細胞的生長。,55,（二）應用酶工程改變藥用酶的性質(zhì)Changing the nature of medicinal enzymes by enzyme engineering,56,（三）應用抗體工程設(shè)計新型抗體,基因工程抗體制備是根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基

37、因水平對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體?；蚬こ炭贵w技術(shù)的著眼點在于盡量減少鼠源成分，保留原有抗體的親和力和特異性。借助于基因工程技術(shù)，既可以對完整抗體，又可以對抗體片段進行改造。,57,人－鼠嵌合抗體的構(gòu)建過程,58,（四）應用糖鏈工程設(shè)計新型糖蛋白類藥物,大多數(shù)有臨床應用價值的蛋白質(zhì)為糖蛋白，糖鏈對蛋白質(zhì)的生物功能及活性起著重要作用。通過糖基化工程可以延長重組蛋白藥物的半衰期，提高重組蛋白藥

38、物的靶向性和對于蛋白酶的抗性，增加抗體分子的效應功能。 EPO是一個高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，由165個氨基酸殘基組成，其成分約有60%蛋白質(zhì)和40%糖（重量百分比）。研究表明EPO的糖基化不影響其體外生物學活性，但卻可延長體內(nèi)半衰期。受此啟發(fā)，Amgen公司的科學家發(fā)明了一種新型的促紅細胞生成蛋白（novel erythropoiesis stimulating protein，NESP）。與EPO相比，NESP在33和88

39、位各增加了1個N-糖基化位點。NESP的體內(nèi)半衰期是EPO的3倍，從而達到了減少用藥次數(shù)的目的。,59,（四）應用糖鏈工程設(shè)計新型糖蛋白類藥物,常用的對糖鏈進行改造的方法有：①通過定點突變技術(shù)增加或減少蛋白質(zhì)的糖基化位點，從而增加或減少蛋白質(zhì)表面的糖鏈；②在體外通過化學或酶法對糖鏈進行修飾；③細胞內(nèi)由一系列糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶組裝成糖基化途徑來催化蛋白質(zhì)的糖基化。,60,第三節(jié) 生物技術(shù)與藥物制備,應用基因工程和細胞工程生產(chǎn)藥物

40、應用發(fā)酵工程生產(chǎn)藥物 利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 應用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)用化學法難以合成的藥物 應用生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工藝,61,一、應用基因工程和細胞工程生產(chǎn)藥物,62,二、應用基因工程和細胞工程生產(chǎn)藥物,幾十年來，發(fā)酵工程技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的許多方面取得了巨大的進展，如規(guī)模化生產(chǎn)抗生素、維生素、氨基酸、β-胡蘿卜素等。 另外，目前微生物發(fā)酵正成為開辟紫杉醇新來源的途徑之一。1993年Stierle等首次報道了真菌安德烈紫杉菌通過發(fā)酵也能

41、產(chǎn)生紫杉醇，該菌株連續(xù)3周的發(fā)酵液中每升含紫杉醇幾納克。美國華盛頓大學研究人員運用現(xiàn)代生物技術(shù)，將紫杉醇合成酶基因轉(zhuǎn)入紫杉醇產(chǎn)生菌中，有可能建構(gòu)高產(chǎn)紫杉醇的“工程菌”，預計此工程紫杉醇的產(chǎn)量比天然真菌提高幾千倍。,63,三、利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物Producing drugs by transgenic animals,64,Micromanipulator,65,66,從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA,67,三、利用

42、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 Producing drugs by transgenic animals,68,Normal mice,Transgenic mice with GFP,69,許多國家相繼成立生物技術(shù)公司專門從事用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)“轉(zhuǎn)基因藥物”，并各具特色。如：美DNX公司的“制藥工廠”用轉(zhuǎn)基因豬 環(huán)球基因藥物公司用轉(zhuǎn)基因奶牛 基因酶公司用轉(zhuǎn)基因山羊 英國藥物蛋白公司則用轉(zhuǎn)基因綿

43、羊等。,三、利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 Producing drugs by transgenic animals,70,三、利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 Producing drugs by transgenic animals,產(chǎn)量高：前者在每升乳汁中可得幾十克產(chǎn)物，而后者在每升培養(yǎng)液中只能獲得幾毫克成本低：轉(zhuǎn)基因動物只需正常的飼養(yǎng)條件，耗資極少，而微生物或動物細胞培養(yǎng)則需用昂貴的反應器用于生產(chǎn)藥物的轉(zhuǎn)基因動物都是哺乳動物，與人類的

44、親緣關(guān)系比細菌、酵母等要接近得多，所以其產(chǎn)品具有與人體自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相同的生物活性,71,三、利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 Producing drugs by transgenic animals,72,三、利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物 Producing drugs by transgenic animal,73,四、應用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)用化學法難以合成的藥物,利用生物體系（如各種細胞和酶等）作催化劑實現(xiàn)有機合成的生物合成和生物轉(zhuǎn)化方法學是一

45、門以有機合成化學為主，與生物學密切聯(lián)系的交叉學科，它是當今有機合成化學的研究熱點，也是21世紀生物有機化學和生物技術(shù)研究的新生長點。 生物催化體系是迄今為止人類所知的最高效和最具有選擇性的溫和催化體系。生物體中的酶以遠遠超出人們想象的高速度催化各種生化反應。酶不僅在生物體內(nèi)，也能在生物體外促進天然的和人工合成的化學分子的諸多轉(zhuǎn)化反應，并且顯示出優(yōu)良的化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。因此生物合成和生物轉(zhuǎn)化反應提供了許多常規(guī)化學方法不

46、能或不易合成的化合物的合成方法。,74,五、應用生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工藝,75,第四節(jié) 生物技術(shù)藥物,生物技術(shù)藥物（biotechnological drug, biotech drug）是指采用DNA重組技術(shù)或其他新生物技術(shù)生產(chǎn)的用于預防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白或核酸類藥物，如細胞因子、纖溶酶原激活劑、重組血漿因子、生長因子、融合蛋白、受體、疫苗、單克隆抗體、反義核酸、小干擾RNA等。,76,一、治療類藥物,1．細胞因子

47、類藥物細胞因子是由免疫細胞及相關(guān)細胞產(chǎn)生的一類調(diào)節(jié)細胞功能的高活性、多功能的多肽分子，不包括免疫球蛋白、補體和一般生理性的細胞產(chǎn)物。細胞因子按其功能及與免疫學的關(guān)系可分為：①具有抗病毒活性的細胞因子，如干擾素；②具有免疫調(diào)節(jié)活性的細胞因子，如白細胞介素類以及轉(zhuǎn)化生長因子-?；③具有炎癥介導活性的細胞因子，如腫瘤壞死因子；④具有造血生長活性的細胞因子，如集落刺激因子、促紅細胞生成素、干細胞因子、白血病抑制因子等。,77,2．激

48、素類藥物 激素類藥物就是以人或動物激素（包括與激素結(jié)構(gòu)、作用原理相同的有機物）為有效成分的藥物。 如雄性激素、胰島素、生長激素等。,78,3．酶類藥物按其對疾病的防治，可將酶類藥物主要分為以下幾個方面： ①與治療胃腸道疾病有關(guān)的酶類藥物，如胰酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、 纖維素酶等；②與治療炎癥有關(guān)的酶類藥物，如菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶；③抗腫瘤的酶類藥物，如天冬酰胺酶。另外，還有多種藥用酶，如

49、與血纖蛋白溶解作用有關(guān)的酶，尿激酶、鏈激酶、纖溶酶等；治療青霉素引起過敏反應的青霉素酶；分解黏多糖的玻璃酸酶；預防齲齒的葡聚糖酶以及治療與血管收縮有關(guān)循環(huán)障礙的激肽釋放酶。,79,4．單克隆抗體藥物由于單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高、精確性強等優(yōu)點，它被用于多種疑難病癥（特別是腫瘤）的治療。利用單克隆抗體治療癌癥主要有兩種方法：一是制備抗腫瘤的單克隆抗體；二是以單克隆抗體作為載體，攜帶藥物，有效殺傷癌細胞。這是利用單克隆抗體與

50、腫瘤細胞表面抗原的高度親和力，直接殺傷癌細胞或攜帶殺傷腫瘤細胞的藥物濃集于腫瘤細胞上，特異地殺傷腫瘤細胞，而又不影響正常細胞。這就避免了傳統(tǒng)抗癌藥好壞不分，無目的殺傷的副作用。,80,生物導彈—單克隆抗體 Biological missile——monoclonal antibody,,Radioimmunoconjugate mechanism of action affecting target cells, nearb

51、y tumor and normal cellsCourtesy of Peter McLaughlin, 2002,,81,5. 基因治療藥物,應用現(xiàn)代生物技術(shù)對疾病發(fā)病機理的研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)生與基因的異常變化和基因的缺陷有關(guān)，這就使基因治療研究和應用隨之出現(xiàn)。基因治療就是將某種基因以某中方法直接轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使其彌補體內(nèi)異?；蛉毕莸幕颍蜃屧摶蛟隗w內(nèi)持續(xù)表達體內(nèi)缺少的活性物質(zhì)，以達到治療的目的。 如向

52、體內(nèi)注入抑癌基因可使癌細胞向正常細胞分化；向體內(nèi)注入能促使血管再生的成纖維細胞生長因子（FGF）的基因，可實現(xiàn)FGF在人體內(nèi)的持續(xù)表達，用于治療冠心病等。多種疾病的基因治療已處于臨床試驗階段。,82,基因治療的ex vivo及 in vivo途徑,83,鳳凰新聞----基因療法使失明小狗重見光明,84,http://www.bioon.com 生 物 谷 網(wǎng) 站    2007年4月24日，美國一家生物技

53、術(shù)公司Introgen  （Nasdaq:  INGN）宣布開始其p53基因藥Advexin的III期臨床研究的療效分析。普遍認為，p53基因產(chǎn)物是最重要的癌癥抑制蛋白，其表達缺陷或功能缺陷在腫瘤中最為常見。Advexin正是利用這一發(fā)現(xiàn)，在患者體內(nèi)或腫瘤局部表達正常的p53蛋白。I和II期臨床研究提示，Advexin對實體腫瘤有明顯的療效。這是自我國2001年批準“今又生”上市以來，國際上第

54、一個以p53表達為基礎(chǔ)的基因治療藥物進入上市審批程序。還沒有發(fā)現(xiàn)其他基因治療藥上市，盡管有1400個在臨床研究的不同階段。,85,中國基因治療Ⅱ型糖尿病研發(fā)成果有重大進展,光明網(wǎng)上海6月14日電　記者從在上海生物制品研究所舉行的世博會荷蘭“生命科學周”—基因治療專題研討會上獲悉：中國科研人員在基因治療Ⅱ型糖尿病的研發(fā)工作有了重大進展，已進入中試后期階段，引起國內(nèi)外生命科學界高度重視，也成為本屆世博活動中國科技發(fā)明成果展示的一個靚點。從

55、至今為止的實驗報告和中試研究情況看：在所公布的動物實驗數(shù)據(jù)中可以看到，使用基因藥物后血糖得到迅速控制和下降直至正常，在11個月內(nèi)沒有出現(xiàn)反彈，從而對基因治療提出了“整體激活”的新概念。,86,二、預防類藥物,,87,88,三、診斷類藥物,1．酶聯(lián)免疫診斷試劑,89,2．診斷用單克隆抗體 單克隆抗體的特異性強，大大提高了抗原-抗體反應的特異性，減少了和其它物質(zhì)發(fā)生交叉反應的可能性，使試驗結(jié)果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活

56、性的單一性，使抗原-抗體區(qū)應結(jié)果便于控制，利于標準化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗制成。,90,3．診斷用基因芯片 基因芯片還具有可同時檢測多種疾病或多個檢測位點的優(yōu)點。,91,第五節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展與醫(yī)藥領(lǐng)域之未來,92,一、現(xiàn)在的疑難病癥將被攻克,93,二、人們的用藥概念將會發(fā)生改變,94,三、人造器官將不再是化學合成的高分子材料,95,目前，曾經(jīng)在裸鼠背上成功復制“人耳”的國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目首席科學家曹

57、誼林教授又有新突破，他已經(jīng)在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)出來了“體外再生耳朵”。曹教授說，比起前幾年他在國際上首次應用組織工程技術(shù)在裸鼠體內(nèi)再生出人耳廓形軟骨，現(xiàn)在的技術(shù)已經(jīng)又向前邁進了一大步。隨著人類生命奧秘的揭曉，有朝一日人體就會像一輛汽車一樣，哪個零件壞了，可再買一個新的換上。,96,據(jù)英國《泰晤士報》2007年10月10日報道，英國諾丁漢特倫特大學的61歲的哲學家和行為藝術(shù)家斯迪拉克宣布，澳大利亞的一家細胞組織中心在他的手臂上移植了一只用他自