rolB、rolC基因?qū)D(zhuǎn)Ri質(zhì)粒三倍體毛白楊的轉(zhuǎn)化.pdf

1、Ri質(zhì)粒上含有誘根基因即rol基因，將Ri質(zhì)?；騿蝹€或幾個rol基因組合導(dǎo)入植物體內(nèi)均能提高植物的生根能力，但是某些植物在轉(zhuǎn)入rol基因后往往會使植株表現(xiàn)出一些不良的變異，如出現(xiàn)了植株矮化、葉面皺縮、節(jié)間縮短、分支能力增強等性狀，對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生很大的影響。為減少rol基因?qū)χ参镌斐傻牟涣甲儺?，本文以劉興菊研究的轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒30148菌株的三倍體毛白楊3個無性系為研究對象，通過對葉片再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，建立了高效離體再生系統(tǒng)

2、和遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將ro/B、rolC誘根基因?qū)朕D(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的三倍體毛白楊，對部分轉(zhuǎn)化再生植株進行了形態(tài)鑒定、PCR檢測和GUS組織化學(xué)染色檢測，并對轉(zhuǎn)化植株形態(tài)及生長變異和葉片解剖結(jié)構(gòu)進行了初步研究，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1．進行了葉片外殖體高效再生系統(tǒng)的研究，篩選出轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的三倍體毛白楊葉片誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg．L<'-1>+NAA0.05mg．L<'-1>，誘導(dǎo)不定根的適宜培養(yǎng)基為：MS

3、+NAA0.1mg．L<'-1>。并以此種誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基，研究了暗培養(yǎng)對誘導(dǎo)葉片不定芽的影響，結(jié)果表明，暗培養(yǎng)5d對不定芽誘導(dǎo)是有利的。 2．通過卡那霉素(Km)敏感性試驗，確定了誘導(dǎo)葉片外殖體不定芽的Km臨界耐受濃度為30mg．L<'-1>。同時研究了頭孢噻肟鈉(CTX)對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的三倍體毛白楊葉片不定芽的影響和對農(nóng)桿菌的抑菌效果，結(jié)果表明，CTX適宜的抑菌濃度為400 mg．L<'-1>。 3．對影響農(nóng)

4、桿菌轉(zhuǎn)化效率的幾個主要因素進行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的三倍體毛白楊葉片外殖體適宜的侵菌時間是8min，侵染后共培養(yǎng)2d可獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。 4．分別將含質(zhì)粒pCMB-B：GUS和pPCV002-CaMVC的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒的三倍體毛白楊葉片共培養(yǎng)，通過在50mg．L<'-1>Km的培養(yǎng)基上篩選后，獲得了Km抗性植株，對部分抗性植株進行了PCR檢測，證明rolB、rolC基因已整合到轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒三倍體毛白楊的基因組中，對部分PCR

5、檢測呈陽性的pCMB-B：GUS轉(zhuǎn)基因無性系進行組織化學(xué)染色分析表明，GuS基因主要在根尖、莖及葉脈維管束組織中特異表達(dá)。 5．進行了轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)及生長變異的研究，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒三倍體毛白楊相比，大部分轉(zhuǎn)rolB基因無性系植株矮化，葉面積增加，莖分支能力增強，節(jié)間距縮短，生根率及根數(shù)量降低，高生長量減少；大部分轉(zhuǎn)rolC基因無性系葉面由原來的皺縮變?yōu)槠秸?，莖分支能力增強，節(jié)間距縮短明顯，生根率、根數(shù)量及高生長量增加。

6、 6．對轉(zhuǎn)基因植株葉片解剖結(jié)構(gòu)及組織厚度進行了觀察，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因無性系葉片解剖結(jié)構(gòu)變化不明顯。大部分轉(zhuǎn)rolB基因無性系葉片厚度、葉肉厚度與其轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒無性系對照相比差異顯著，柵欄組織和海綿組織厚度差異不顯著，50％的轉(zhuǎn)roIB基因無性系的表皮厚度與其轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒無性系對照相比差異顯著。大部份轉(zhuǎn)rolC基因無性系葉片厚度、葉肉厚度與其轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒無性系對照相比差異不顯著。轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒不同無性系在轉(zhuǎn)rolC基因后，柵欄組織厚度變異程度不同，