基因重組和雜交育種培訓課程

1、基因重組和雜交育種培訓課程,,第三節(jié) 基因重組和雜交育種,凡把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（gene recombination）或遺傳重組（genetic recombination），簡稱重組。,細胞水平的雜交包含分子水平上的重組。,基因重組是雜交育種的理論基礎。在方向性還是自覺性方面，比誘變育種前進了一大步。且可消除某一菌株在經過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產

2、量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。,一、原核生物的基因重組,原核生物的基因重組形式很多，機制較原始。,特點：① 片段性，僅一小段DNA序列參與重組；② 單向性，即從供體菌向受體菌（或從供體基因組向受體基因組）作單方向轉移；③ 轉移機制獨特而多樣，如接合、轉化和轉導等。,受體菌（recipient cell，receptor）直接吸收供體菌（donor cell）的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉化或轉化

3、作用。,通過轉化方式而形成的雜種后代，稱轉化子（transformant）。,（一）轉化（transformation） 1. 定義,自然遺傳轉化（natural genetic transformation）,人工轉化（artificial transformation）,,原核生物Streptococcus pneumoniae（肺炎鏈球菌）、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、N

4、eisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Xanthomonas（黃單胞菌屬）等。,2. 轉化微生物的種類,真核微生物Saccharomy cescerevisiae（釀酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脈孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。,3. 感受態(tài)（competence）,感受

5、態(tài)是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉化的一種生理狀態(tài)。,研究發(fā)現(xiàn)，能發(fā)生轉化的受體細胞都處于感受態(tài)。,感受態(tài)細胞（competent cell）具有攝取外源DNA能力的細胞。,自然感受態(tài)是細胞一定生長階段的生理特性，受細菌自身的基因控制；,人工感受態(tài)則是通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內。（該過程與細菌自身的遺傳控制無關?。?感受態(tài)受遺傳控制，但也存在個體差異。感受態(tài)出現(xiàn)的時間不

6、同；感受態(tài)細胞所占比例和維持時間不同；外界環(huán)境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2＋等對感受態(tài)也有重要影響。,調節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子。,膜相關DNA結合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）,細胞壁自溶素（autolysin）,幾個核酸酶,,,4. 轉化因子（transforming principle）,轉化因子的本質是離體的DNA片段。一般只有15kb左右。,在不同的微生

7、物中，轉化因子的形式不同。良好的轉化因子有dsDNA（最宜于細胞表面結合）、ssDNA和質粒DNA，通常不能與核染色體組發(fā)生重組。,轉化的頻率通常為0.1％～1.0％，最高為20％。能發(fā)生轉化的最低DNA濃度極低，為化學方法無法測出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL ）。,,5. 轉化過程,（1）自然遺傳轉化（簡稱自然轉化）,1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus p

8、neumoniae）的轉化現(xiàn)象，轉化過程研究得較深入的就是這種G＋細菌。,目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉化的能力,進行自然轉化，需要二方面必要的條件：,①建立了感受態(tài)的受體細胞,②外源游離DNA分子,枯草芽孢桿菌的自然轉化過程（革蘭氏陽性菌的轉化模型）,,strR，存在抗鏈霉素的基因標記,strS，有鏈霉素敏感型基因標記,自然轉化過程的特點：,a）對核酸酶敏感；,c）轉化是否成功及轉化效率的高低主要取決于轉化（DNA）供體菌和受體

9、菌之間的親源關系；,d）通常情況下質粒的自然轉化效率要低得多；,b）不需要活的DNA給體細胞；,提高質粒的自然轉化效率的二種方法：1）使質粒形成多聚體，這樣進入細胞后重新組合成有 活性的質粒的幾率大大提高；2）在質粒上插入受體菌染色體的部分片段，或將質粒轉化進含有與該質粒具有同源區(qū)段的質粒的受體菌——重組獲救。,（2）人工轉化,用CaCl2處理細胞，電穿孔等是常用的人工轉化手段。,在自然轉化的基礎上發(fā)展和建立的一項細菌基

10、因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術。,不是由細菌自身的基因所控制；,用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,質粒的轉化效率高；,指用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細胞或其原生質體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。,6. 轉染（transfection）,噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產生有活性的病毒顆粒,現(xiàn)在把DNA轉移至動物細胞的過程也稱轉染,提純的噬菌體DNA以轉化的

11、（而非感染）途徑進入細胞并表達后產生完整的病毒顆粒。,特點：,（二）轉導（transduction）,通過缺陷噬菌體（defective phage）的媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉導。獲得新遺傳性狀的受體細胞，就稱轉導子（transductant）。,由噬菌體介導的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中,能將

12、一個細菌宿主的部分染色體或質粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉導噬菌體。,細菌轉導的二種類型：,普遍性轉導,局限性轉導,,流產普遍轉導,完全普遍轉導,,1.普遍轉導（generalized transduction）,通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌任何小片段DNA進行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉導。,一般用溫和噬菌體作為普遍轉導的媒介。,（1）完全普遍轉導,簡稱普遍轉導或完全轉導（complete tran

13、sduction）。經轉導嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內進行交換、整合和復制，使其成為一個遺傳性狀穩(wěn)定的重組體，稱作普遍轉導子，這種現(xiàn)象就稱普遍轉導。,Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的野生菌株,Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的營養(yǎng)缺陷型突變株,P22嗜菌體,供體菌,受體菌,,轉導模型,供體菌,受體菌,,,轉導媒介—嗜菌體,,誤包,轉導顆粒

14、,,普遍轉導子,雙交換,同源配對,10-6～10-8,S.typhimurium的P22噬菌體、E.coli的P1噬菌體、Bacillus subtilis的PBS1和SP10等噬菌體都能進行完全普遍轉導。,供體菌轉導媒介——嗜菌體受體菌,,（2）流產普遍轉導,簡稱流產轉導（abortive transduction）。經轉導嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內既不進行交換、整合和復制，也不迅速消

15、失，而僅進行轉錄、轉譯和性狀表達，這種現(xiàn)象就稱流產轉導。,受體菌,,外源DNA,,細胞分裂,外源基因經轉錄、轉譯而形成的少量酶,,獲得外源DNA,獲得少量酶,不斷稀釋,特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,DNA不能復制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產物，形成微小菌落。,普遍性轉導的三種后果：,進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉導子。,,流產轉導（abortive transduc

16、tion）,,轉導DNA不能進行重組和復制，但其攜帶的基因可經過轉錄而得到表達。,,特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，轉導失敗。,,DNA不能復制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產物，形成微小菌落。,2.局限轉導（specialized transduction， restricted transduction）,指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者

17、的基因組整合、重組，形成轉導子的現(xiàn)象。 最初于1954年在E. coliK12中發(fā)現(xiàn)。,特點：① 只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側的基因；② 該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；③ 缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主染色體過程中，發(fā)生低頻率（～10-5）“誤切”（不正常切離，abnormal excesion）或由于雙重溶源菌的裂解而形成；④ 局限轉導噬菌體的產生要通過UV等因素對

18、溶源菌的誘導并引起裂解后才產生。,局限轉導,低頻轉導,高頻轉導,,根據(jù)轉導子出現(xiàn)頻率的高低分類,溫和噬菌體感染,,整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發(fā)生溶源化,,溶源菌因誘導而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上,部分缺陷的溫和噬菌體,,把供體菌的少數(shù)特定基因轉移到受體菌中,,缺陷噬菌體在宿主細胞內能夠象正常的λDNA分子一樣進行復制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉導顆粒。但沒有正

19、常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細胞后，通過DNA整合進宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉導子。,E. coli的λ嗜菌體和φ80嗜菌體具有局限轉導的能力。,3.溶源轉變（lysogenic conversion）,正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主核基因組上，而使宿主獲得了除免異性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉變。,一個與轉導相似又不同的現(xiàn)象,溶源轉變與轉導的不同？,a）這是一種不攜帶任何外源基因的正常時

20、菌體；,b）是嗜菌體的基因內而不是供體菌的基因提供了宿主的信性狀；,,c）新性狀是宿主細胞溶源化時的表型，而不是經遺傳重組形成的穩(wěn)定轉導子；,d）獲得的性狀可隨嗜菌體的消失而同時消失；,（三）接合（conjugation，mating）,供體菌（“雄性”）通過性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質粒或其攜帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞，就是接合子（c

21、onjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗,通過細胞與細胞的直接接觸而產生的遺傳信息的轉移和重組過程,中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！,大腸桿菌的接合機制,接合作用是由一種被稱為F因子的質粒介導,F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細菌產生性菌毛（sex pili）及控制接合過程進行的20多個基因。,

22、含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛,不含F(xiàn)因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛,F因子為附加體質?？擅撾x染色體在細胞內獨立存在，可插入（整合）到染色體上,F因子的四種細胞形式,a）F-菌株， 不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。,d）F′菌株

23、，Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體時， 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。 細胞表面同樣有性菌毛。,（四）原生質體融合（protoplast fusion）,通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定的重組子的過程，稱為原生質體融合。由此法獲得的重組子，成為融合子（fusant）。,選擇兩個有特殊價值的并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本,脫壁酶,細菌或放

24、線菌可用溶菌酶或青霉素處理，真菌可用蝸牛酶或其他相應的脫壁酶等,離心聚集,在高滲溶液中稀釋,加入促融合劑或電脈沖,各種選擇性培養(yǎng)基,原生質體融合的主要步驟是：,原生質體融合的重組頻率已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）；同種的不同菌株間或種間進行融合，屬間、科間甚至更遠緣的微生物或高等生物細胞間的融合，以期達到生產性狀更為優(yōu)良的新物種。,二、真核微生物的基因重組,有性雜交,準性雜交,原生質體融合,遺傳轉化,,（一）有性雜交

25、（sexual hybridization）,雜交是在細胞水平上發(fā)生的一種遺傳重組方式。有性雜交，一般指不同遺傳型的兩性細胞間發(fā)生的接合和隨之進行的染色體重組，并產生新遺傳型后代的一種育種技術。,（二）準性雜交（parasexual hybridization）,準性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種兩性生殖方式，這是一種在同種而不同菌株的體細胞間發(fā)生融合，它可不借減數(shù)分裂而導致低頻率基因重組并產生重組子。,準性生殖過程：

26、（1）菌絲聯(lián)結（anastomosis） （2）形成異核體（heterocaryon） （3）核融合（nuclear fusion）或核配（caryogamy） （4）體細胞交換（somatic crossing-over）和單倍體化,準性雜交育種（breeding by parasexuality）：① 選擇親本：選擇來自不同菌株的合適的營養(yǎng)缺陷型作為準性雜交的親本。② 強制異合：用人為的方法強制兩菌株形成異核體。 ③ 移