載體構建流程v3

1、DNA重組技術實驗原理、方法和步驟實驗原理1DNA重組技術重組DNA(RecombinantDNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟：1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法將PCR擴增產(chǎn)物快速克隆至質粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A)從而產(chǎn)生一A粘

2、性末端的性質設計一種線性載體使之含有一T粘性末端可直接插入PCR產(chǎn)物在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。2）將重組DNA分子轉化宿主細胞。3）克隆選擇增殖：將轉化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉化的細菌能在培養(yǎng)基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細菌。4）收獲擴增后的培養(yǎng)細胞，提取重組

3、DNA分子（質粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。2質粒DNA的小量制備常見的質粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH12.0~12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而