蘋(píng)果組織培養(yǎng)

1、1蘋(píng)果組織培養(yǎng)研究進(jìn)展摘要：蘋(píng)果組織培養(yǎng)技術(shù)研究取得了較大的突破，本文從蘋(píng)果組培的幾個(gè)方面入手，從器官、組織、原生質(zhì)體及再生體系的建立等綜述其研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：組培；再生；誘導(dǎo)蘋(píng)果為多年生木本植物在遺傳上都是雜合體由于對(duì)控制性狀的基因了解較少，使得通過(guò)常規(guī)雜交育種來(lái)培育新品種有一定困難特別是改良現(xiàn)有品種的某一兩個(gè)不良性狀更顯棘手。本世紀(jì)50～60年代開(kāi)展的植物組織培養(yǎng)技術(shù)和70年代后期在植物分子生物學(xué)和組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的植物基因工

2、程為解決這些困難開(kāi)辟了新的途徑[1]。1離體微繁及其應(yīng)用1.1離體繁殖的應(yīng)用用組織培養(yǎng)的方法加速繁殖新引或培育的品種，可不受季節(jié)的限制和影響，可以很容易將一些病原脫除，獲得無(wú)病毒植株。傳統(tǒng)蘋(píng)果都采用田間種植來(lái)保存種質(zhì)，占地面積大，管理成本高，并容易受炭蟲(chóng)危害，引種或種質(zhì)交換過(guò)程容易攜帶病蟲(chóng)原，采用組織培養(yǎng)物作為保存物，不僅節(jié)省土地、管理方便、也便于國(guó)內(nèi)外種質(zhì)交流，通過(guò)組培技術(shù)能夠從體細(xì)胞和組織再生完整植株。蘋(píng)果誘變選種多年來(lái)一直存在嵌合

3、體現(xiàn)象，利用蘋(píng)果體細(xì)胞胚技術(shù)進(jìn)行突變體選擇，將會(huì)使突變育種效率提高，同時(shí)體細(xì)胞胚技術(shù)也為研制蘋(píng)果人工種子奠定了基礎(chǔ)。1.2.蘋(píng)果直接器官發(fā)生型1.2.1芽莖段、芽體這兩種外植體其上已有芽或胚芽的分化，培養(yǎng)就是使其已分化的芽萌發(fā)，長(zhǎng)出新梢，其中用莖段培養(yǎng)方法進(jìn)行蘋(píng)果優(yōu)良品種和砧木大規(guī)模繁殖已成為常規(guī)方法。白樺等（1998）使用蘋(píng)果“麗紅”嫩梢莖段，6月中旬取正在生長(zhǎng)的嫩梢，自來(lái)水沖洗干凈，切成帶腋芽的莖段70%酒精浸10秒鐘0.1%HgC

4、l2溶液消毒10分鐘無(wú)菌水沖洗5次接種時(shí)將莖段接觸消毒液的切口部分切掉外植體長(zhǎng)約1cm左右，接種于MS附加BA1.0mgL培養(yǎng)基上，取得了良好的效果[2]，也證明了培養(yǎng)基中添加BA對(duì)腋芽萌發(fā)的重要性。張巨祥等（1986）在秋天紅富士蘋(píng)果采摘之后選取健壯無(wú)病成年樹(shù)徒長(zhǎng)枝條埋于地下冷藏越冬。第二年春天取出枝條在溫室進(jìn)行催芽。待芽萌動(dòng)后用自來(lái)水將枝條沖洗千凈切成帶有1～2個(gè)節(jié)的切段在95%酒精中浸泡1分鐘再用0.1%氯化汞液浸泡10分鐘最后用

5、無(wú)菌水沖洗4～5次按常規(guī)無(wú)菌操作方法，當(dāng)培養(yǎng)基中IAA濃度為0.3mgL時(shí)，6BA濃度以2mgL為最好，300mgL有利于苗的正常生長(zhǎng)并可防止玻璃苗的產(chǎn)生[10]。1.2.2莖尖培養(yǎng)3金”、“巖富1號(hào)”、“嘎拉”和“北斗”葉片為試材，發(fā)現(xiàn)植株再生率和再生葉塊的再生植株數(shù)最多的品種為北斗其次為嘎拉再次為巖富1號(hào)、喬納金、長(zhǎng)富2號(hào)，秋富1號(hào)、金矮生最差。誘導(dǎo)葉片再生植株的適宜BA、TDZ、NAA濃度分別為2.5mgL、0.5～1.0mgL、

6、0.2mgL，葉片暗培養(yǎng)最適時(shí)間為15天。但本試驗(yàn)僅為單因素試驗(yàn)。吳雅琴等（2006）以昌紅蘋(píng)果組培苗為試材，新梢頂部1～3節(jié)新展開(kāi)的葉片作為外植體分別接種在分化的培養(yǎng)基上黑暗處理15天昌紅蘋(píng)果葉片不定芽的最高再生率為100%。研究發(fā)現(xiàn)與BA相比TDZ更適于昌紅蘋(píng)果離體葉片再生培養(yǎng)基中添加適宜濃度的TDZ可獲得較高的再生率。當(dāng)TDZ濃度為1.0mgLNAA0.5mgL時(shí)再生效率顯著提高葉片平均再生率可達(dá)100%再生葉片平均出芽率為21左

7、右。但TDZ再生的芽呈簇狀莖難以伸長(zhǎng)不如BA再生的芽健壯，將TDZ再生的芽轉(zhuǎn)入含BA的培養(yǎng)基中，芽的狀態(tài)就恢復(fù)正常[12]。這個(gè)結(jié)果與王關(guān)林的結(jié)論是一致，王關(guān)林等（1992）以新喬納金葉片為試驗(yàn)材料，交替使用分別含TDZ和BA的培養(yǎng)基可顯著提高其再生芽效率，和BA相比適宜于蘋(píng)果葉片再生芽的TDZ的濃度范圍很寬[13]。1.3.2胚狀體發(fā)生途經(jīng)蘋(píng)果離體葉片再生過(guò)程中能夠產(chǎn)生與正常合子胚相似的結(jié)構(gòu)這種結(jié)構(gòu)稱(chēng)為胚狀體也可稱(chēng)做體細(xì)胞胚胎。達(dá)克東

8、等（2004）以蘋(píng)果栽培品種嘎拉為試管苗，研究了蘋(píng)果離體葉片直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系和外植體直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的形態(tài)學(xué)特征，蘋(píng)果直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程經(jīng)歷原胚、球形胚、心形胚、子葉形胚、成熟胚等階段，子葉形胚以前的階段沒(méi)有觀察到形態(tài)學(xué)多樣性，發(fā)育至子葉形胚期的直接體細(xì)胞胚胎表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)多樣性，分別觀察到一子葉胚、兩子葉胚、三子葉胚、杯狀胚、多子葉胚、畸形胚等，這些類(lèi)型的胚最終都能發(fā)育成正常的成熟胚進(jìn)而發(fā)育成小植株[14]。臧運(yùn)祥等（

9、2006）利用喬納金無(wú)菌苗葉片培養(yǎng)，成功地誘導(dǎo)出胚狀體并獲得再生植株，研究表明喬納金最佳胚性細(xì)胞誘導(dǎo)配方為MSBA2.0mgLIAA6.0mgL24D0.3mgL，黑暗處理以6d，獲得胚性細(xì)胞然后轉(zhuǎn)入MSBA2.0mgL培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生誘導(dǎo)率可達(dá)96.1%[15]。1.3.3花藥培養(yǎng)由于蘋(píng)果多數(shù)品種自花不孕，幾乎不能通過(guò)雜交得到純系，以往蘋(píng)果的雜交育種，都以雜合體品種（系）作親本具有很大盲目性，由花培得到單倍體植株，再進(jìn)行染色體加

10、倍，獲得純合的二倍體植株，就能在短期內(nèi)得到各種基因類(lèi)型的純系，利用這些純系進(jìn)行配合力的測(cè)定，找出具有優(yōu)勢(shì)的雜交組合便可以有預(yù)見(jiàn)地獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)的理想品種，使雜交育種的目的性增強(qiáng)。吳絳云（1981）用“黃太平”、“金紅”的花藥形成愈傷組織，黃太平得到單倍體植株但金紅僅分化小苗一株后死亡。所用的培養(yǎng)基為MSNAA0.1～0.5mgLBA0.5～1mgL生物素5.0mgL[21]。丁愛(ài)萍等（1992）等研究原生質(zhì)體時(shí)采用新紅星在四月末

11、采集花蕾，接種到MS培養(yǎng)基上形成愈傷組織后轉(zhuǎn)移到MSBA0.1mgL2.4D2mgL的培養(yǎng)基上進(jìn)行原生質(zhì)的分離培養(yǎng)[22]，MS培養(yǎng)基是進(jìn)行蘋(píng)果花藥培養(yǎng)較好的培養(yǎng)基，適宜誘導(dǎo)的是單核花藥期。2蘋(píng)果原生質(zhì)再生植株原生質(zhì)體是“無(wú)壁細(xì)胞”可以直接攝取外源DNA或細(xì)胞器，或利用異種原生質(zhì)體融合而創(chuàng)造體細(xì)胞雜種，直接用于植物的遺傳改良[17]，在生產(chǎn)應(yīng)用上具有很大潛力。選擇分離原生質(zhì)體的適宜材料是分離培養(yǎng)原生質(zhì)體成功的關(guān)鍵，主要包括基因型(種或品