常用實(shí)驗(yàn)方法和所需試劑的配制

1、（一）（一）Westernblot實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1.Westernblot主要實(shí)驗(yàn)試劑主要實(shí)驗(yàn)試劑溴酚藍(lán)（BromphenolBlue）麗春紅（PonceauS）考馬斯亮藍(lán)（CoomassiebrilliantblueR250）吐溫20（Tween20）β巰基乙醇(βMercaptoethanol)十二烷基硫酸鈉（SDS）過硫酸銨（APS）TEMED聚丙烯酰胺凝膠單體貯備溶液4濃縮膠緩沖液4濃縮膠緩沖液甘氨酸Tris堿脫脂奶粉牛血清白蛋白（B

2、SA）硝酸纖維素膜（NC膜）蛋白質(zhì)Marker和預(yù)染Marker通用蛋白裂解提取試劑BCA法蛋白定量試劑盒Bradfd法蛋白定量試劑盒兔源性抗抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgGECL超敏發(fā)光液定影液、顯影液、X光膠片曝光盒其他試劑（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）2.Westernblot主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法（1）10%SDS溶液:SDS粉末1g加雙蒸水10mL使其溶解，室溫保存。②取0.5mL勻漿液移入新

3、的2mLEP管內(nèi)，加1mL蛋白抽提試劑并混勻，靜置10min后（偶有顛倒混勻），12000g4℃離心10min。③棄去上清保留蛋白質(zhì)膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小時(shí)使蛋白質(zhì)膜充分溶解。（2）總蛋白濃度的測定（）總蛋白濃度的測定（BCA法）法）①配制統(tǒng)一的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為1mgmL）制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取BSA標(biāo)準(zhǔn)品

4、溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS溶液補(bǔ)足到2000μL，配成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝后20℃?zhèn)溆?。②配制BCA工作液：按50：1的比例將BCA試劑盒內(nèi)的A試劑與B試劑進(jìn)行混合，配成BCA工作液。室溫保存，1d內(nèi)使用。③樣品處理：取各樣品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待測樣品。④加樣：先于酶標(biāo)板上樣孔內(nèi)加入200μLBCA工作液，再分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)

5、品及待測樣品各20μL，酶標(biāo)儀上震蕩3min，充分混勻。⑤測定：將酶標(biāo)板置于恒溫水浴箱中，37℃孵育30min。用MRK3型酶標(biāo)儀測定562nm波長下各孔吸光度值（opticaldensity，OD），采用Softmax5.2軟件計(jì)算各樣本蛋白質(zhì)濃度。（3）樣品濃度的配平和制備）樣品濃度的配平和制備①配平：按測定的各樣品蛋白質(zhì)濃度，用2%SDS溶液配平各樣品總蛋白濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將組織的總蛋白濃度調(diào)為1mgmL。②制備：將配平后的

6、樣品與5上樣緩沖液按4：1的比例混合。100℃水浴10min，部分4℃保存用于電泳，部分20℃保存?zhèn)溆谩＃?）樣品內(nèi)蛋白含量的檢測）樣品內(nèi)蛋白含量的檢測①凝膠的配制：配制12%分離膠和5%濃縮膠（配制方法見附錄）。②上樣：分別用Eppendf微量移液器吸取蛋白質(zhì)Marker或樣品各10μL，將槍尖的插入加樣孔的底部，緩慢地將樣品或Marker加入加樣孔，避免有氣泡產(chǎn)生。③電泳：濃縮膠：電壓100V、電流400mA，電泳20min；分離膠