微流控高通量生物分析：從單細(xì)胞到復(fù)雜生物微環(huán)境.pdf

1、隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)進入了后基因組時代，為了進一步揭開生命的奧秘，所需的生物信息規(guī)?？涨暗谋?。建立新一代高通量的生物分析技術(shù)是當(dāng)今許多研究領(lǐng)域的迫切需求。建立高通量的生物信息獲取技術(shù)將廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)，蛋白組學(xué)，藥物篩選，干細(xì)胞分化等諸多領(lǐng)域。然而生物信息的高通量獲取依然是一個巨大的挑戰(zhàn)，其挑戰(zhàn)主要來自兩方面：一方面是如何更精準(zhǔn)地獲取生物學(xué)信息，如單細(xì)胞信息；另一方面是如何從更為真實的復(fù)雜生物微環(huán)境中高通量地獲取生物學(xué)

2、信息。傳統(tǒng)的高通量分析方法主要是基于流式細(xì)胞，微孔板檢測器和點樣儀。其局限性在于無法準(zhǔn)確的記錄單細(xì)胞的動態(tài)響應(yīng)，并且不能重建復(fù)雜三維的細(xì)胞微環(huán)境。近年來，微流控芯片由于其精確可控，高通量，尺度與細(xì)胞組織相匹配等優(yōu)點受到了廣泛的關(guān)注。同時基于微流控芯片的高通量分析呈現(xiàn)多元化發(fā)展，以滿足不同領(lǐng)域的需求。本文針對單細(xì)胞和復(fù)雜生物微環(huán)境的高通量分析，建立了基于瓊脂糖水凝膠、表面潤濕性圖案化和PDMS微通道的三類微流控芯片。
　　本研究主要

3、內(nèi)容包括：⑴建立一種基于瓊脂糖微流控芯片的高通量單細(xì)胞基因組損傷分析方法。該方法可以在一塊芯片上同時檢測多至10000個細(xì)胞的單細(xì)胞基因組損傷，在保證更好的重現(xiàn)性的前提下，通量上相比傳統(tǒng)方法提高了一百倍。通過采用瓊脂糖作為微流控芯片的加工材質(zhì)，利用瓊脂糖的超親水特性自動進樣細(xì)胞并在通道內(nèi)自動排列形成單細(xì)胞陣列。隨即包埋細(xì)胞于瓊脂糖微流體芯片中，并裂解電泳，分離并檢測損傷DNA。該方法同樣可以用于單細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的研究，可廣泛應(yīng)用于藥

4、物篩選和細(xì)胞毒性實驗等領(lǐng)域。⑵建立一種自定義濃度梯度芯片用于高通量單細(xì)胞多藥耐藥性分析。該芯片所形成的濃度梯度由分配通道長短比例決定，與液體流速和驅(qū)動壓力無關(guān)，該設(shè)計保證了濃度梯度形成的穩(wěn)定性并簡化了芯片設(shè)計易于集成化。該芯片可以在單細(xì)胞乃至單細(xì)胞器水平分析數(shù)百個的細(xì)胞的多藥耐藥性，可以實時監(jiān)控單細(xì)胞的藥物外流。更進一步的，該方法可以用于化療增強劑的高通量篩選。⑶建立一種低成本，快速且便攜化的細(xì)菌富集和檢測裝置。該芯片由瓊脂糖材質(zhì)加工而

5、成，利用瓊脂糖材質(zhì)的超親水性和水滲透性，自動進樣細(xì)菌懸液于微通道中，由于該芯片通道末端封閉設(shè)計，細(xì)菌被富集收集于通道末端。該芯片最多可以實現(xiàn)細(xì)菌樣品一千萬倍的富集。在一百萬倍富集的條件下，其細(xì)菌捕獲效率高達90％以上。該方法被證實同樣可以用于血液樣品和尿液樣品的富集檢測。通過結(jié)合免疫熒光染色，該方法成功檢測到了臨床病人樣品中感染的細(xì)菌。⑷建立基于三維梯形微流體通道的細(xì)胞密度梯度組裝新方法，通過控制微流體通道不同區(qū)域范圍內(nèi)通道高度，在均一

6、的細(xì)胞懸液通入微流體通道后，待細(xì)胞隨重力沉降，便能形成細(xì)胞密度梯度。通過該方法組裝細(xì)胞密度梯度可在10分鐘內(nèi)完成?；谠摲椒ㄍㄟ^順序組裝可以組裝成多細(xì)胞種類細(xì)胞密度梯度。通過改變?nèi)S微流體通道中單層通道的形狀可以控制細(xì)胞密度梯度的圖案化。該組裝方法可以模擬真實組織中的細(xì)胞密度梯度，重建其細(xì)胞間相互作用。該細(xì)胞模型可以用于高通量研究該復(fù)雜細(xì)胞微環(huán)境下細(xì)胞的行為和功能，我們研究發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞密度下對碲化鎘量子點毒性的耐受性有不同的表現(xiàn)。⑸基

7、于表面潤濕性的異質(zhì)性復(fù)雜生物微環(huán)境高通量組裝平臺，我們進一步提出了一種可以同時高通量組裝數(shù)以千計異質(zhì)性生物微環(huán)境的方法。采用該表面潤濕性圖案化芯片，最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時加工百萬計的單一組分液滴/微凝膠陣列。通過對單一組分液滴陣列融合與分裂等操作，可以在10分鐘內(nèi)組裝數(shù)以千記的異質(zhì)性細(xì)胞微環(huán)境陣列。該方法可以精確控制陣列中每一個細(xì)胞微環(huán)境陣列中的物理信號（包括圖案化，材料的機械性能等），材料組成，化學(xué)信號（化學(xué)濃度，和多組分化學(xué)因子空間分

8、布）以及細(xì)胞間相互作用（細(xì)胞密度梯度以及多細(xì)胞種類空間分布與相互作用）。該方法可以做為一種高通量分析平臺，廣泛用于組織工程，藥物篩選和干細(xì)胞研究等領(lǐng)域。⑹基于表面潤濕性的異質(zhì)性復(fù)雜土壤-微生物微環(huán)境高通量組裝平臺，我們將其命名為芯片微地球。采用該表面潤濕性圖案化芯片，最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時加工數(shù)萬計的單一組分土壤微環(huán)境。也可以通過結(jié)合點樣，在十分鐘內(nèi)加工幾百個異質(zhì)性的土壤異質(zhì)性微環(huán)境陣列。我們可以精確控制土壤微環(huán)境中的圖案化，土壤礦物質(zhì)成

9、分，土壤有機質(zhì)含量和成分，土壤微生物菌落等。通過微流體芯片，可以精確控制土壤周圍的化學(xué)微環(huán)境，其中包括離子強度，酸堿度等因素。我們接著在該土壤芯片模型上研究了土壤的動態(tài)組裝過程，我們觀察到均一性的土壤懸液在組裝過程中，土壤有機質(zhì)和細(xì)菌會組裝至土壤微生物復(fù)合物的邊緣和角落。其現(xiàn)象原理同咖啡圈效應(yīng)，且該組裝中的異質(zhì)性分布與其土壤的礦物組成成分之間有著一定的規(guī)律。該芯片模型模擬的現(xiàn)象重建了真實土壤形成過程中組分異質(zhì)性分布的過程，并證明了物理作