微流控單細胞電阻檢測系統(tǒng)的開發(fā)與實驗研究.pdf

1、單細胞水平的生物物理特性表征，可有效闡明細胞的基本結(jié)構(gòu)、功能信息及病理狀態(tài)，揭示細胞間的個體差異性，對于細胞的種類鑒別與癌癥等重大疾病的早期診斷等具有非常重要的意義。由于具有與細胞尺度相匹配的微米級通道，微流控芯片在細胞的微環(huán)境控制、運動調(diào)控及性能表征等方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。近年來，微流控已經(jīng)發(fā)展成為一個涉及機械、電子、材料、流體、生物和醫(yī)學(xué)等諸多學(xué)科的前沿技術(shù)，研究開發(fā)基于微流控技術(shù)的單細胞物理特性表征方法，有望成為新一代即時檢測儀

2、器的關(guān)鍵突破口。在回顧片上單細胞物理特性表征技術(shù)的最新研究現(xiàn)狀與存在問題的基礎(chǔ)上，本文開發(fā)了一套便攜式的通用電阻抗測量系統(tǒng)，并先后研制出具有不同功能的微型庫爾特計數(shù)器、阻抗流式細胞儀和微型阻抗分析儀，以期在全血中循環(huán)腫瘤細胞的鑒別、計數(shù)和狀態(tài)監(jiān)測等方面提供一套有益方法，取得下列創(chuàng)新性研究成果:
　　(1)在細胞介電理論與阻抗測量方面:研究建立描述單細胞懸浮液系統(tǒng)介電特性的Maxwell混合模型與等效電路模型，并探索系統(tǒng)介電特性在時

3、域和頻率內(nèi)的嚴格對應(yīng)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，提出一種基于偽隨機m序列相關(guān)辨識原理獲取細胞寬頻阻抗譜的新方法，在極短的0.5115ms內(nèi)測得從1.953KHz到1MHz共512個頻率下的細胞阻抗信息。編寫LabVIEW同步采集程序，利用數(shù)據(jù)采集卡和電流放大器實現(xiàn)m序列激勵信號的施加與響應(yīng)信號的獲取;開發(fā)MATLAB信號分析處理程序，對采集到的響應(yīng)信號依次進行快速M變換和快速傅里葉變換得到交流阻抗信息。通過制作一個已知電學(xué)參數(shù)的RC測試電路，驗證

4、了基于偽隨機m序列寬頻阻抗測量技術(shù)的可靠性。由于激勵信號的生成、響應(yīng)信號的獲取以及阻抗信號的分析處理等均通過軟件編程實現(xiàn)，開發(fā)的電阻抗測量系統(tǒng)具有良好的便攜性，且可通過調(diào)用相應(yīng)的程序方便地實現(xiàn)細胞的直流或交流阻抗檢測。
　　(2)在腫瘤細胞直流阻抗檢測方面:研制一種集成慣性聚焦技術(shù)與液體電極傳感技術(shù)的微型庫爾特計數(shù)器，旨在實現(xiàn)細胞的高通量計數(shù)、體積表征與種類鑒別。利用非對稱彎流道內(nèi)的微流體慣性效應(yīng)將細胞穩(wěn)定聚焦在特定的橫向位置，保

5、證了后續(xù)直流電阻抗測量的穩(wěn)定性和準確性。通過向Ag/AgCl電極腔內(nèi)填充高電導(dǎo)率溶液形成的液體電極結(jié)構(gòu)縮短了檢測區(qū)域的長度，有效提高了測得直流阻抗峰值對被測對象尺寸的靈敏度。通過測量標(biāo)準的聚苯乙烯粒子先后對樣品流量與電極腔補充液流量進行優(yōu)化，并在測得阻抗峰值與粒子體積間建立了嚴格的線性關(guān)系，獲得高達每秒5000個粒子的檢測通量。將優(yōu)化后的微型庫爾特計數(shù)器用于人體乳腺癌細胞系MCF-7細胞和人體白細胞的測量，得到MCF-7細胞與白細胞的平

6、均直徑分別為14.28μm和9.01μm。最后，根據(jù)兩種細胞直流阻抗峰值的統(tǒng)計結(jié)果，設(shè)定鑒別閾值并成功在混合細胞樣品中識別出MCF-7細胞。
　　(3)在腫瘤細胞交流阻抗檢測方面:研制一種集成粘彈性聚焦技術(shù)與寬頻阻抗測量技術(shù)的阻抗流式細胞儀，旨在實現(xiàn)細胞的連續(xù)交流阻抗檢測與種類鑒別。利用方形直流道內(nèi)PEO溶液的慣性效應(yīng)與粘彈性效應(yīng)將細胞規(guī)則排列于流道的中心，并通過微流道底部的ITO平面電極將開發(fā)的寬頻阻抗測量技術(shù)用于分析流動態(tài)細胞

7、的交流阻抗信息（幅值和相位角）。通過比較有無聚焦單元兩種情況下測得的粒子阻抗信號驗證了粘彈性聚焦預(yù)處理的必要性，并系統(tǒng)研究了不同樣品流速下MCF-7細胞在方形直流內(nèi)的粘彈性聚焦行為。隨后，分析不同頻率下粒子通過檢測區(qū)域時引起的阻抗變化情況，確定交流阻抗信號分析的最佳頻率，并在此基礎(chǔ)上探索了流道尺寸與樣品流速對粒子阻抗測量的影響。最后，將提出的阻抗流式細胞儀用于MCF-7細胞和白細胞的檢測，根據(jù)測得的阻抗峰值統(tǒng)計結(jié)果設(shè)定鑒別閾值，成功在混

8、合細胞樣品中鑒別出MCF-7細胞。
　　(4)在腫瘤細胞狀態(tài)監(jiān)測方面:研制一種集成流體動力學(xué)捕獲技術(shù)與寬頻阻抗測量技術(shù)的微型阻抗分析儀，旨在實現(xiàn)腫瘤細胞的自動捕獲與狀態(tài)監(jiān)測。設(shè)計蛇形流道捕獲陣列，基于最小流阻路徑原理實現(xiàn)細胞的確定性、自動化捕獲，并通過與捕獲單元對應(yīng)的ITO電極陣列，將開發(fā)的寬頻阻抗測量技術(shù)用于捕獲細胞的狀態(tài)監(jiān)測。制作三種具有不同蛇形流道結(jié)構(gòu)的微流控芯片，系統(tǒng)研究了MCF-7細胞在微流道內(nèi)的流體動力學(xué)捕獲行為，獲得