基于微流控技術(shù)的融合細胞檢測與分離方法研究.pdf

1、細胞分選是指從大量非均一細胞群體中獲取性質(zhì)均一的目標(biāo)細胞的一種技術(shù)，如從大量紅細胞中分選其中含有的少量白細胞，從細胞融合液中將融合細胞從未融合細胞中分離出來等，這些對于細胞生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)都具有重要意義。目前，融合細胞的分離還只能采用落后的人工方式(容易損傷細胞且效率低下)或者利用價格昂貴而且細胞用量大的流式細胞儀來進行，這些對細胞融合技術(shù)的廣泛應(yīng)用都有嚴(yán)重阻礙作用。
　　 因此，本文運用MEMS技術(shù)及微流控芯片分析技術(shù)來研究一

2、種融合細胞無損分離方法，在此基礎(chǔ)上建立了集微流體聚焦、微粒(細胞)光學(xué)檢測與微粒(細胞)分離于一體的融合細胞分離系統(tǒng)。該檢測與分離系統(tǒng)能夠在單一微流控芯片上完成細胞排隊、光學(xué)檢測、目標(biāo)細胞的分離等功能。其工作原理是利用微流體的層流流動特性及微流控制中的鞘流理論，將微粒(細胞)聚集于流動通道中央特定位置，再基于細胞光散射原理，利用光學(xué)檢測系統(tǒng)，檢測出細胞種類；然后利用電場產(chǎn)生的電滲力控制包裹著目標(biāo)細胞的液體的流動方向，將目標(biāo)細胞收集到預(yù)定

3、的儲液池中。
　　 具體而言，論文主要完成了以下幾部分工作：
　　 ①理論研究及仿真計算。
　　 論文根據(jù)微流控理論，對微芯片中流體的流動進行了理論研究及CFD數(shù)值仿真，研究了在兩側(cè)鞘流作用下，中間樣品流的聚焦寬度與鞘流及樣品流的流速比之間的關(guān)系，數(shù)值仿真結(jié)果與理論相互印證；同時，還對鞘流溝道與樣品流溝道之間不同夾角時聚焦流的流動進行了數(shù)值仿真，根據(jù)仿真結(jié)果設(shè)計了最適合進行無損細胞分離的芯片結(jié)構(gòu)。
　　

4、②設(shè)計制作檢測與分離芯片。
　　 選擇不同的材料制作了光學(xué)檢測與分離芯片，并根據(jù)庫爾特(Coulter)理論設(shè)計制作了阻抗檢測芯片；嘗試采用多種方法制作微芯片及芯片加工所需的母板(如硅基SU-8光刻)，并比較了各種制作方法的優(yōu)劣，根據(jù)實際加工條件最終選擇了利用PCB來制作檢測及分離芯片的母板；采用二次模塑法成功制作了適合多種細胞分離的通用PDMS芯片，實現(xiàn)了宏觀進樣與微觀進樣之間無粘膠劑的自然銜接。
　　 ③組建檢測及分

5、離系統(tǒng)。
　　 論文組建了光學(xué)檢測系統(tǒng)，將光纖集成在芯片上，自動對準(zhǔn)后直接傳送激光信號并接收細胞的前向散射光，簡化了光學(xué)系統(tǒng)；利用光電探測器將反映細胞大小的前向散射光轉(zhuǎn)化為電信號并用數(shù)據(jù)采集器采集該信號；自制暗盒，將芯片、光電探測器等固定于暗盒中，避免雜散光干擾；用自編的軟件根據(jù)采集到的光電信息的大小控制分離信號以產(chǎn)生合適的電滲力；利用電滲力作為驅(qū)動力促使目標(biāo)細胞偏轉(zhuǎn)，流向設(shè)定的儲液池。
　　 論文根據(jù)Coulter原理

6、(細胞通過微孔時會引起微孔兩端電極之間阻抗的變化，其阻抗變化大小與細胞大小相關(guān))搭建了阻抗檢測裝置，通過測試電極之間的阻抗變化而得到與細胞大小相關(guān)的信息。
　　 ④完成聚焦流實驗、細胞阻抗檢測實驗、微粒(細胞)光學(xué)檢測與分離實驗。
　　 利用有色液體進行了聚焦流實驗，利用標(biāo)準(zhǔn)微粒進行了排隊實驗，這兩組實驗結(jié)果證明液流聚焦理論與CFD數(shù)值仿真是互相吻合的，論文擬采用的分離方法是可行的。
　　 對小鼠成骨細胞和HEK

7、-293細胞進行了阻抗檢測實驗，結(jié)果表明，細胞通過微溝道時兩端電極之間的電阻變化值雖然能反映細胞的大小，但在目前的實驗條件下電阻值波動太大，不適合作為分離的依據(jù)。
　　 論文利用標(biāo)準(zhǔn)微粒和各種細胞(煙草原生質(zhì)體、HEK293、酵母菌)進行了光學(xué)檢測及分離實驗，實驗結(jié)果表明，細胞體積相差不大的情況下，系統(tǒng)能正確地檢測出細胞的大小，并將融合細胞分離出來；最后，論文對煙草原生質(zhì)體的融合細胞進行了分離實驗，能在誤差允許的范圍內(nèi)將融合細胞