基于微流控技術(shù)的融合細(xì)胞檢測與分離方法研究.pdf

1、細(xì)胞分選是指從大量非均一細(xì)胞群體中獲取性質(zhì)均一的目標(biāo)細(xì)胞的一種技術(shù)，如從大量紅細(xì)胞中分選其中含有的少量白細(xì)胞，從細(xì)胞融合液中將融合細(xì)胞從未融合細(xì)胞中分離出來等，這些對于細(xì)胞生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)都具有重要意義。目前，融合細(xì)胞的分離還只能采用落后的人工方式(容易損傷細(xì)胞且效率低下)或者利用價(jià)格昂貴而且細(xì)胞用量大的流式細(xì)胞儀來進(jìn)行，這些對細(xì)胞融合技術(shù)的廣泛應(yīng)用都有嚴(yán)重阻礙作用。
　　 因此，本文運(yùn)用MEMS技術(shù)及微流控芯片分析技術(shù)來研究一

2、種融合細(xì)胞無損分離方法，在此基礎(chǔ)上建立了集微流體聚焦、微粒(細(xì)胞)光學(xué)檢測與微粒(細(xì)胞)分離于一體的融合細(xì)胞分離系統(tǒng)。該檢測與分離系統(tǒng)能夠在單一微流控芯片上完成細(xì)胞排隊(duì)、光學(xué)檢測、目標(biāo)細(xì)胞的分離等功能。其工作原理是利用微流體的層流流動特性及微流控制中的鞘流理論，將微粒(細(xì)胞)聚集于流動通道中央特定位置，再基于細(xì)胞光散射原理，利用光學(xué)檢測系統(tǒng)，檢測出細(xì)胞種類；然后利用電場產(chǎn)生的電滲力控制包裹著目標(biāo)細(xì)胞的液體的流動方向，將目標(biāo)細(xì)胞收集到預(yù)定

3、的儲液池中。
　　 具體而言，論文主要完成了以下幾部分工作：
　　 ①理論研究及仿真計(jì)算。
　　 論文根據(jù)微流控理論，對微芯片中流體的流動進(jìn)行了理論研究及CFD數(shù)值仿真，研究了在兩側(cè)鞘流作用下，中間樣品流的聚焦寬度與鞘流及樣品流的流速比之間的關(guān)系，數(shù)值仿真結(jié)果與理論相互印證；同時，還對鞘流溝道與樣品流溝道之間不同夾角時聚焦流的流動進(jìn)行了數(shù)值仿真，根據(jù)仿真結(jié)果設(shè)計(jì)了最適合進(jìn)行無損細(xì)胞分離的芯片結(jié)構(gòu)。
　　

4、②設(shè)計(jì)制作檢測與分離芯片。
　　 選擇不同的材料制作了光學(xué)檢測與分離芯片，并根據(jù)庫爾特(Coulter)理論設(shè)計(jì)制作了阻抗檢測芯片；嘗試采用多種方法制作微芯片及芯片加工所需的母板(如硅基SU-8光刻)，并比較了各種制作方法的優(yōu)劣，根據(jù)實(shí)際加工條件最終選擇了利用PCB來制作檢測及分離芯片的母板；采用二次模塑法成功制作了適合多種細(xì)胞分離的通用PDMS芯片，實(shí)現(xiàn)了宏觀進(jìn)樣與微觀進(jìn)樣之間無粘膠劑的自然銜接。
　　 ③組建檢測及分

5、離系統(tǒng)。
　　 論文組建了光學(xué)檢測系統(tǒng)，將光纖集成在芯片上，自動對準(zhǔn)后直接傳送激光信號并接收細(xì)胞的前向散射光，簡化了光學(xué)系統(tǒng)；利用光電探測器將反映細(xì)胞大小的前向散射光轉(zhuǎn)化為電信號并用數(shù)據(jù)采集器采集該信號；自制暗盒，將芯片、光電探測器等固定于暗盒中，避免雜散光干擾；用自編的軟件根據(jù)采集到的光電信息的大小控制分離信號以產(chǎn)生合適的電滲力；利用電滲力作為驅(qū)動力促使目標(biāo)細(xì)胞偏轉(zhuǎn)，流向設(shè)定的儲液池。
　　 論文根據(jù)Coulter原理

6、(細(xì)胞通過微孔時會引起微孔兩端電極之間阻抗的變化，其阻抗變化大小與細(xì)胞大小相關(guān))搭建了阻抗檢測裝置，通過測試電極之間的阻抗變化而得到與細(xì)胞大小相關(guān)的信息。
　　 ④完成聚焦流實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞阻抗檢測實(shí)驗(yàn)、微粒(細(xì)胞)光學(xué)檢測與分離實(shí)驗(yàn)。
　　 利用有色液體進(jìn)行了聚焦流實(shí)驗(yàn)，利用標(biāo)準(zhǔn)微粒進(jìn)行了排隊(duì)實(shí)驗(yàn)，這兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明液流聚焦理論與CFD數(shù)值仿真是互相吻合的，論文擬采用的分離方法是可行的。
　　 對小鼠成骨細(xì)胞和HEK

7、-293細(xì)胞進(jìn)行了阻抗檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，細(xì)胞通過微溝道時兩端電極之間的電阻變化值雖然能反映細(xì)胞的大小，但在目前的實(shí)驗(yàn)條件下電阻值波動太大，不適合作為分離的依據(jù)。
　　 論文利用標(biāo)準(zhǔn)微粒和各種細(xì)胞(煙草原生質(zhì)體、HEK293、酵母菌)進(jìn)行了光學(xué)檢測及分離實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞體積相差不大的情況下，系統(tǒng)能正確地檢測出細(xì)胞的大小，并將融合細(xì)胞分離出來；最后，論文對煙草原生質(zhì)體的融合細(xì)胞進(jìn)行了分離實(shí)驗(yàn)，能在誤差允許的范圍內(nèi)將融合細(xì)胞