基于血液樣品和微流控芯片技術的細胞分離、PCR擴增及DNA測序方法研究.pdf

1、生命科學是本世紀前沿科學領域之一，生命科學的高速發(fā)展離不開先進的分析儀器與技術，隨著生命科學的蓬勃發(fā)展，分析儀器和分析科學也正經(jīng)歷著深刻的變革，其中一個日益明顯的發(fā)展趨勢就是儀器設備的微型化、集成化與便攜化。微流控芯片技術作為微流控分析系統(tǒng)的核心部分已發(fā)展成為μTAS中最活躍的領域，血液是一種重要的生物分析樣本，含有極其豐富的有關體內(nèi)所有組織和器官功能的信息，因此對血液樣品進行分析是醫(yī)學和科學領域研究關注的焦點。本文用微流控芯片技術設計

2、制作了細胞水平和DNA水平上對人血液進行分析的芯片，實現(xiàn)了利用高梯度磁分離技術對未經(jīng)標記的血細胞進行直接分離、直接全血PCR擴增及流動焦磷酸測序法人血液DNA的SNP位點檢測，展示了微流控芯片在生物分析中的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　 第一章簡要論述了微流控芯片血細胞操控與分離、微流控芯片PCR擴增和焦磷酸測序微流控芯片的研究情況。
　　 第二章在基于高梯度磁分離技術(High Gradient Magnetic Separatio

3、n, HGMS)的玻璃微流控芯片連續(xù)血細胞分離研究中，設計并制作了一個在細胞水平上進行血液分析的玻璃微流控芯片系統(tǒng)，是基于HGMS技術連續(xù)分離血細胞，并且成功地進行了血細胞分離。玻璃芯片用光刻法和熱封合法加工制成，包括一個進口和三個出口，一個直徑69μm的鎳絲被定位在分離通道的中間，通道上寬149μrn、深73μrn，將鎳絲定位的一對嵴高約10μm，這兩個嵴是在刻蝕通道的同時形成的。當在芯片旁放置一個與通道平行的0.3T的永磁鐵，在永磁

4、鐵形成的磁場中，鎳絲就會在分離通道中誘導出高梯度磁場，稀釋了41倍的血液樣品中的紅細胞在流量范圍為0.12～0.92μL/min時不斷地被分離，在流量為0.23μL/min時，在中間出口的紅細胞分離率為93.7％。通過用牛血清白蛋白調(diào)整支持介質(zhì)的密度，減輕了細胞的沉降現(xiàn)象。在分離過程中使用了量子點標記，在可視熒光下觀察細胞的分離行為。發(fā)現(xiàn)并討論了鎳絲兩側(cè)血細胞分布不均勻現(xiàn)象。
　　 第三章在直接全血PCR擴增方法研究及其在靜態(tài)微

5、池型PCR芯片上的應用中，是在DNA水平上應用擴增技術進行血液分析微流控芯片的研究。首先通過將改進的PCR程序和優(yōu)化的PCR反應體系結(jié)合起來進行直接全血PCR擴增，成功的進行了血液內(nèi)源基因P53片段（大約543bp）和外源的靶目標λDNA片段(大約500bp)的擴增。此方法還可應用于不同處理的血液樣品，如不同抗凝劑（和檸檬酸鈉）血液、未加抗凝劑的新鮮血液、濾紙上的血斑等。然后在自制的靜態(tài)微池型PCR芯片上，利用此PCR擴增方法也成功的實

6、現(xiàn)了芯片上的直接全血PCR擴增，PCR擴增得到兩個不同長度的血液內(nèi)源靶目標P53基因和K-ras基因(157bp)片段，在10μL的反應體系中只需加入0.5μL的血液，此PCR芯片是采用ITO玻璃為基底，用模糊PID算法來控制芯片的溫度程序，芯片加熱器的有效面積是25×25mm，一個聚乙烯管粘在玻璃面上做為PCR反應池。在整個過程中，僅涉及芯片加熱程序，因此所做的PCR芯片可適用于野外檢測等。
　　 第四章在毛細管流動焦磷酸測序

7、方法的建立及其在單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測中的應用中，是在DNA水平上應用測序技術進行血液分析微流控芯片的研究。利用毛細管反應和磁固定的方法搭建了一個流動焦磷酸測序毛細管微流控系統(tǒng)平臺，利用PCR擴增血液DNA制備了帶有生物素標記的模板，通過生物素與鏈親和素親和作用將模板固定在磁珠上，利用永磁鐵將連著測序模板的磁珠固定在毛細管上，光電倍增管做為檢測器以及縫管陣列和注射泵做為進樣系統(tǒng)。對所建立的毛細管流動焦磷酸測序方法反應條件等因素進行

8、了研究；在初步優(yōu)化的基礎上成功地用于血液DNA的SNP位點研究。制作了一個磁屏蔽盒用來消除磁場對光電倍增管檢測器檢測靈敏度的影響。此平臺搭建簡單，不涉及微加工操作，而且通過與縫管陣列進樣系統(tǒng)聯(lián)用，實現(xiàn)了微量、連續(xù)進樣，滿足了流動焦磷酸測序反應對進樣系統(tǒng)的要求，且操作簡單、方便，在該平臺上結(jié)合高靈敏度的BAMPER方法建立了高靈敏度的毛細管流動焦磷酸測序方法，成功地對人21號染色體上的一個SNP位點rs8130833進行了檢測，得到了與傳