低溫 3D 打印雙相磷酸鈣-聚乙烯醇-富血小板纖維蛋白支架的制備及其成骨作用研究.pdf

1、研究背景：
　　大段骨缺損的修復一直是困擾骨科醫(yī)生的難題，目前修復策略包括自體骨、異體骨和人工材料移植等。自體骨移植雖是治療的金標準，但移植過程中會造成取骨區(qū)出血、感染；同種異體骨移植存在著免疫排斥、傳播疾病的風險；骨組織工程的迅速發(fā)展給大段骨缺損的修復提供了一種較為可行的方法。傳統(tǒng)方法制備支架的內部結構往往是不可人為控制的，而3D打印技術可針對骨缺損的形狀為患者量身定做支架外形；同時，由于制作過程受到電腦的嚴格操控，可以精細控制

2、支架的孔徑、孔道連通率，這對支架發(fā)揮功能具有重要的作用。
　　3D打印過程中，生物陶瓷漿料從打印噴頭擠出，通過疊層制造的方法堆積成型，漿料中可以加入生物因子或者特定藥物，整個打印過程控制在低溫下進行，含有生物因子或者藥物的漿料通過打印噴頭擠出，不破壞生物因子和藥物的活性。雙相磷酸鈣(BCP)是一種生物陶瓷材料，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，目前較多的應用于骨組織工程、骨水泥等的相關研究。聚乙烯醇（PVA）以其良好的生物安全性和

3、力學特性備受研究者青睞。富血小板纖維蛋白（PRF）是第二代血小板濃聚物，制備方法簡單，三維網(wǎng)狀結構網(wǎng)羅大量血小板激活釋放的生物因子，隨著纖維蛋白網(wǎng)狀結構的降解緩慢釋放，促進PRF置入部位的組織愈合。目前，鮮有將以上三種材料混合進行低溫3D打印骨組織工程支架的報道。本研究以BCP/PVA/PRF為原料，按照BCP粉末質量/PVA溶液體積/血液體積1：1：1的比例于4℃條件下打印成孔徑可控的三維多孔支架，對照組選用傳統(tǒng)的注模成型技術制備。本

4、研究通過測定各組支架的表征、體外實驗評價支架細胞學作用，體內植入橈骨缺損觀察缺損修復的效果，比較不同方法制備支架的促成骨作用。
　　研究目的：
　　1、分別通過3D打印制備BCP/PVA支架、BCP/PVA/PRF支架和使用注模成型法制備非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，比較四組支架理化性質。
　　2、通過對接種于不同支架上的骨髓基質干細胞(BMSCs)的粘附、增殖和成骨分化的進行觀察，體外實驗比

5、較四組支架的細胞相容性。
　　3、通過兔橈骨臨界性骨缺損修復實驗，比較四組支架促進骨缺損修復的能力。
　　研究方法：
　　1、3D打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，注模成型法制備非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，利用掃描電鏡（SEM）觀察打印支架的宏觀孔隙結構以及表面微結構；測定接觸角、孔隙率、壓縮模量和親水性。
　　2、提取原代兔骨髓基質干細胞，通過流式分析鑒定，鑒定B

6、MSCs純度，CCK8實驗與Annexin V/PI流式分析檢測四組不同支架的細胞相容性及毒性，測定四組支架細胞種植效率，免疫熒光染色比較細胞于四組支架的粘附能力。通過CCK8實驗測定不同時間點吸光值以及掃描電鏡觀察不同時間點細胞增殖情況。分別通過測定支架上細胞的堿性磷酸酶（ALP）活性，qRT-PCR法測定細胞COL-1、ALP、RUNX-2、OPN等成骨相關基因表達量以評價支架誘導細胞定向成骨分化能力。
　　3、將四組不同支架

7、分別植入兔橈骨臨界性骨缺損模型。分別于4、8、12周取材，通過Micro-CT掃描三維重建觀察新生骨，采用四環(huán)素-鈣黃綠素熒光雙標實驗測定礦物沉積率、Van-Gieson染色觀察四組支架促進體內成骨的作用。
　　研究結果：
　　1、掃描電鏡顯示：3D打印支架較注模成型支架具有可控的孔隙結構，支架表面孔徑均勻，材料表面粗糙，打印組支架孔隙率高于非打印組（P＜0.05），但伴隨孔隙率提高的同時，支架的壓縮模量降低；四組支架材料的

8、親水性能良好，不加PRF的支架接觸角為(72±4.82)°，加入PRF的支架接觸角為(67±4.49)°（P＜0.05）。
　　2、原代培養(yǎng)BMSCs生長旺盛，流式細胞儀檢測CD34-CD44+細胞表面抗原檢測結果符合BMSCs特征，CCK8實驗與Annexin V/PI流式檢測結果發(fā)現(xiàn)四組支架無明顯的細胞毒性（P＞0.05），而種植效率計算發(fā)現(xiàn)打印組支架種植效率低于相應材料的非打印組（P＜0.05），免疫熒光染色檢測細胞粘附狀態(tài)

9、發(fā)現(xiàn)打印BCP/PVA/PRF組和非打印BCP/PVA/PRF組支架上細胞粘附狀態(tài)優(yōu)于非打印BCP/PVA組和打印BCP/PVA組，細胞種植于支架并培養(yǎng)，3D打印組細胞生長速度最快，生長量最多。細胞種植于支架并培養(yǎng)至7天時掃描電鏡結果顯示四組細胞均在支架上粘附鋪展良好，打印組材料內部孔隙也長滿細胞，而非打印組內部沒有細胞長入。較之空白對照組，四組支架均促進BMSCs的ALP活性表達，但打印BCP/PVA/PRF組ALP活性最高（P＜0.

10、05），同時打印BCP/PVA/PRF組的成骨相關基因于7天及14天表達量也最高（P＜0.05）。
　　3、Micro-CT三維重建結果顯示：在4周、8周和12周，打印BCP/PVA/PRF組支架誘導成骨速度最快，成骨量最多，并且隨著新生骨的長入，支架材料緩慢降解，四組支架的骨修復效果明顯高于空白對照組（P＜0.05）。熒光雙標計算礦物沉積率顯示：四組支架礦化速率顯著高于空白對照組，打印BCP/PVA/PRF組礦化速率高于打印BC

11、P/PVA組（P＜0.05）。Van-Gieson染色發(fā)現(xiàn)4周時染成紅色的骨痂包繞著含有PRF的支架，有新生骨組織長入打印支架的孔隙內部；8周時，負載有PRF的支架新生骨組織更多，同時伴隨著新生骨的長入，支架材料邊緣出現(xiàn)降解；12周時，在負載有PRF的支架周圍可見到編織骨及板層骨，并且打印BCP/PVA/PRF組支架大量降解，而其他組板層骨骨質薄且不規(guī)則。
　　研究結論：
　　1、運用低溫3D打印技術可成功制備BCP/PVA

12、/PRF復合生物支架，打印制備過程可保留PRF中細胞因子活性，使細胞因子從支架中緩慢釋放，可控的孔道結構可增加支架孔隙率，但支架的力學強度也隨之下降。
　　2、支架材料細胞相容性實驗顯示無明顯細胞毒性，而且 BMSCs在種植支架上粘附良好，并隨著時間推移增殖迅速，高連通率的孔隙結構使得BMSCs可以長入支架材料的內部，打印支架可促進BMSCs的成骨分化。
　　3、含有PRF的打印支架可促進體內成骨修復，Micro-CT結果顯