氧化還原動態(tài)平衡調(diào)控腦細胞增殖的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是機體發(fā)育的重要組成部分。研究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,對于深入研究神經(jīng)細胞的增殖、分化,以及尋求調(diào)控與干預(yù)細胞的增殖、分化作用的新靶點,具有廣泛而深遠的意義。活性氧(ROS)作為一類重要的信號分子,在機體其它組織(如肝組織)的發(fā)育過程中扮演重要的角色。本實驗類比ROS對肝細胞增殖調(diào)控的研究,探索ROS在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用,以及ROS對腦細胞增殖調(diào)控的信號作用及機制。
　　實驗?zāi)康模?br>　　通過研究大

2、鼠不同發(fā)育時期腦組織氧化還原動態(tài)平衡的變化規(guī)律,探討腦發(fā)育過程中ROS水平的變化與腦組織抗氧化系統(tǒng)活性變化的相互關(guān)系,提出ROS作為信號分子參與調(diào)控腦細胞增殖過程的假說。并以PC12細胞構(gòu)建神經(jīng)細胞體外研究模型,闡明ROS在調(diào)控神經(jīng)細胞增殖中的作用及機制。為進一步尋求調(diào)控與干預(yù)細胞的增殖、分化作用的新靶點,提供實驗依據(jù)。
　　實驗方法和研究方案：
　　1.檢測SD大鼠不同發(fā)育階段腦組織氧化還原動態(tài)平衡的變化規(guī)律,并初步研究R

3、OS對神經(jīng)細胞增殖的調(diào)控。
　　(1)培養(yǎng)不同發(fā)育階段的大鼠原代神經(jīng)元,檢測神經(jīng)元的細胞周期、ROS水平以及PCNA、CyclinD、Rb等增殖蛋白表達的變化。
　　(2)檢測以Nrf2為核心的抗氧化酶譜的表達及活性的變化。
　　(3)分離不同發(fā)育階段大鼠腦組織,提取線粒體,檢測線粒體活力及線粒體ROS水平的變化。
　　2.體外實驗研究ROS對PC12細胞增殖作用的量效關(guān)系,以及在細胞增殖過程中的信號調(diào)控作用。<

4、br>　　(1)構(gòu)建神經(jīng)細胞體外模型——PC12細胞培養(yǎng)模型。觀察PC12細胞的生長特性,繪制生長曲線。
　　(2)分別在PC12細胞培養(yǎng)的過程中給予氧化劑和抗氧化劑的處理,篩選適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?研究ROS水平與PC12細胞增殖作用的量效關(guān)系。
　　(3)通過處理干預(yù)PC12細胞的細胞增殖過程,測定不同處理組細胞細胞周期蛋白CyclinD、PCNA、Rb等的表達,研究ROS在細胞增殖過程中的信號調(diào)控作用。
　　實驗結(jié)果：

5、
　　1.SD大鼠出生后7-15天期間,大鼠腦組織快速發(fā)育,生長發(fā)育速率加快,代謝旺盛,呈現(xiàn)“突發(fā)性”的生長狀態(tài)。同時,ROS的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)的活性處于一個活躍而又平衡的狀態(tài)。
　　2.在大鼠的腦發(fā)育過程中,線粒體活力的變化趨勢與線粒體ROS的變化趨勢相反。在P7~15天“腦突發(fā)生長期”線粒體代謝旺盛,線粒體活力出現(xiàn)短暫的升高,之后又逐漸回落。腦組織線粒體的活力是隨著發(fā)育進程的推進而逐漸升高,線粒體的功能也逐漸完善。<

6、br>　　3.神經(jīng)細胞內(nèi)ROS參與調(diào)控細胞的增殖過程。在大鼠胚胎發(fā)育過程中,腦組織ROS水平由高變低,抗氧化防御系統(tǒng)功能則由低變高,說明ROS水平的變化與神經(jīng)細胞增殖和分化成熟有重要作用。從大鼠胚胎發(fā)育早期一直到大鼠出生后發(fā)育成熟,腦組織的氧化還原維持著動態(tài)平衡,ROS的水平被控制在“合適”的范圍。在腦組織中核心的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2有序地調(diào)控或部分調(diào)控以ROS存在水平為軸心的氧化還原動態(tài)變化;自由基清除酶SOD蛋白表達逐漸下降和抗氧化酶C

7、AT、Gpx和GR等蛋白表達逐漸升高,共同維持穩(wěn)定的氧化還原的動態(tài)平衡。由此可見,大鼠發(fā)育過程中腦組織的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)ROS的水平,而ROS的水平又參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
　　4.使用氧化劑t-叔丁基過氧化氫(t-BHP)和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)分別處理對數(shù)生長期的PC12細胞。t-BHP處理PC12細胞,表現(xiàn)出明顯的劑量–效應(yīng)關(guān)系,適當(dāng)劑量的t-BHP(1μM)可以通過激活ERK通路促進細胞增殖。NAC可以顯著降

8、低細胞ROS水平,并通過激活p38信號通路一定程度地抑制細胞增殖。同時,使用p38抑制劑能夠有效阻斷NAC對細胞增殖的抑制作用。該結(jié)果說明,ROS水平的變化能夠通過激活ERK或p38信號通路,促進或抑制PC12細胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　本課題從大鼠腦組織發(fā)育過程中ROS水平的變化與抗氧化防御系統(tǒng)的變化相矛盾這一現(xiàn)象,提出“大鼠發(fā)育過程中腦組織的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)ROS的水平,而ROS的水平又參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育”的猜想。