鬼臼亞科系統(tǒng)發(fā)育與八角蓮屬的親緣地理學(xué)研究.pdf

1、八角蓮屬（Dysosma）植物隸屬于小檗科(Berberidaceae)鬼臼亞科(Podophylloideae)，其根狀莖含有的生物活性成分鬼臼毒素（Podophylloxotin）等是合成抗癌藥物的前體。該屬植物分布于我國東南、中南至西南地區(qū)，其中，八角蓮(D.versipellis)為廣布種，其余種均為地方特有種。最西部的西藏八角蓮(D.tsayuensis)分布于東喜馬拉雅，最東部的六角蓮(D.pleiantha)間斷分布于我國

2、東部與臺灣。該屬有著近200年的分類歷史，但由于其形態(tài)性狀的變異性以及采樣不足，使得它與近緣屬的分類問題和系統(tǒng)發(fā)育問題一直沒有得到很好地解決。以前的系統(tǒng)發(fā)育和親緣地理學(xué)研究僅涉及其中的少數(shù)種，因此有關(guān)屬內(nèi)7個種的物種形成與分化機制以及該屬的整合分類系統(tǒng)是一個亟需解決的科學(xué)問題?；诒菊n題組對八角蓮屬近10年的材料積累和廣泛的野外資源調(diào)查取樣，在形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，利用系統(tǒng)發(fā)育、生物地理以及群體遺傳學(xué)原理與方法，對鬼臼亞科的系統(tǒng)發(fā)育以及八

3、角蓮屬植物地理分布與物種形成的時間格局與機制進(jìn)行了全面深入的研究，獲得以下主要結(jié)果:
　　1)鬼臼亞科的系統(tǒng)發(fā)育及分化時間:
　　對鬼臼亞科4屬12個種進(jìn)行了廣泛的野外取樣，采集了中國、日本和北美的63個群體材料，采集群體涵蓋了八角蓮屬的整個地理分布區(qū)域。以Wang et al.(2007)的小檗科主要類群的系統(tǒng)發(fā)育樹為基礎(chǔ)（matK、rbcL），補充八角蓮屬缺失的6個種，并對鬼臼亞科12個種增加了葉綠體trnL-trnF、

4、atpH-atpI和ITS和ETS的擴增，聯(lián)合6個片段，通過系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建了鬼臼亞科12個種的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，并結(jié)合兩個化石校正點(小檗科的crown節(jié)點分化時間91 Ma，Ranzania、Berberis和Mahonia三個屬的crown節(jié)點時間45Ma)和鬼臼亞科二次校正點(8.8±1.4 Ma)，利用BEAST進(jìn)行分化時間估算，揭示了鬼臼亞科屬間及屬內(nèi)種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系:鬼臼亞科是一個單系類群(PP=1)，山荷葉屬為一個單系(

5、PP=1)位于鬼臼亞科的基部，八角蓮屬是一個很好的單系(PP=1)，與東亞-北美間斷分布的姐妹類群桃兒七和足葉草組成一個支系，但支持率較低(PP=0.67)。八角蓮屬內(nèi)的廣布種八角蓮不是單系，而是與六角蓮形成并系，分子系統(tǒng)樹支持其它形態(tài)學(xué)種為單系類群。分歧時間估算結(jié)果表明鬼臼亞科的共祖時間為上新世[c.12.67 Ma(10.71-14.56 Ma)];山荷葉屬的共祖時間為7.96(5.19-10.61) Ma;八角蓮屬、桃兒七屬和足葉

6、草屬的分化(7.96-9.14 Ma)與中新世的全球氣候變冷有關(guān)。BBM結(jié)果揭示了八角蓮屬起源于東喜馬拉雅，并自上新世由西向東遷移。在八角蓮屬中，位于西部的云南八角蓮、西藏八角蓮和川八角蓮分化時間較早(7.76-9.14 Ma)，其分化時間與青藏高原早期快速隆升時間(8-13 Ma)一致，由此可知，早期地理隔離導(dǎo)致了西部類群異域成種。
　　2)八角蓮屬種水平親緣地理學(xué)
　　選取八角蓮屬7個種46個群體進(jìn)行了親緣地理學(xué)研究，研

7、究結(jié)果揭示了八角蓮屬內(nèi)7個種的譜系關(guān)系及遺傳多樣性的時空分布格局。3個葉綠體片段（trnL-trnF、trnL-ndhJ、trnS-trnfM）序列變異的遺傳多樣性分析揭示了八角蓮屬共有66個葉綠體單倍型，八角蓮屬水平的遺傳多樣性相對較高（hT=0.929，πT=3.58×10-3），并具有顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)(NST=0.866，GST=0.790，P＜0.05)。廣布種八角蓮的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(hT=0.314;πT=0.2

8、5×10-3)比其它窄域種都高;八角蓮(NST=0.818，GST=0.611，P＜0.05)、小八角蓮(NST=0.865，GST=0.728，P＜0.01)和川八角蓮(NST=0.977，GST=0.870，P＜0.05)的譜系地理結(jié)構(gòu)明顯。TCS單倍型譜系關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均揭示，八角蓮屬共分為6個與地理分布對應(yīng)的譜系(Lineage1-Lineage6)，它包括分布于中國西部的云南八角蓮(Lineage6)、西藏八角蓮(Li

9、neage5)和川八角蓮(Lineage4)依次分化出來。分布于中國中部-東南部的小八角蓮、貴州八角蓮、六角蓮及八角蓮聚成一個單系[Lineage1+(Lineage2+Lineage3)];其中，廣布種八角蓮單倍型分為兩個譜系（西北譜系Lineage2和東南譜系Lineage1），是一個并系類群;單系類群六角蓮(Lineage3)與八角蓮西北部譜系Lineage2為姐妹關(guān)系;小八角蓮和貴州八角蓮沒有獨立分支，小八角蓮(H1，H52-5

10、6)鑲嵌于八角蓮的東南譜系中，并共享單倍型H1;貴州八角蓮的所有個體和小八角蓮共享一個單倍型H55?；贗TS序列分析表明，八角蓮屬內(nèi)7個種沒有共有單倍型。cpDNA與ITS單倍型的譜系關(guān)系在小八角蓮、貴州八角蓮、八角蓮以及六角蓮之間呈現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，表明了這3個種在同域分布區(qū)可能存在雜交與基因漸滲現(xiàn)象。
　　失配分析表明，八角蓮東南譜系(Lineage1)和六角蓮譜系(Lineage3)都經(jīng)歷了顯著的群體擴張，但八角蓮西北譜系(

11、Lineage2)和川八角蓮譜系(Lineage4)長期居留原地。八角蓮東南譜系的擴張時間為更新世早期[1.78 Ma(95％ CI:1.01-3.03 Ma)]，表明氣候變冷導(dǎo)致暖溫帶落葉林下的八角蓮表現(xiàn)出擴張信號。六角蓮的擴張時間為更新世晚期[0.18 Ma(95％ CI:0.00072-0.75 Ma)]，與倒數(shù)第二個間冰期時間一致一致(c.0.25-0.135 Ma)，表明氣候變暖使暖溫帶常綠林的六角蓮呈現(xiàn)擴張信號。
　　

12、3) DNA條形碼(DNA barcoding)
　　通過對9個候選的DNA條形碼(ITS、matK、rbcL、trnL-trnF、trnL-ndhJ、trnS-trnfM、atpH-atpI、rpl32-trnL、rps18-clpp)在鬼臼亞科植物中的鑒定能力進(jìn)行了評估，比較分析了各條形碼的擴增成功率、種內(nèi)和種間變異、barcodinggap，并運用BLAST、DISTANCE和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹方法評估了不同序列的物種鑒定成功率

13、，結(jié)果表明除rps18-clpp外其余8個條形碼對鬼臼亞科12個種的通用性均為100％，其中通用引物ITS擴增的序列種內(nèi)與種間變異的差異、barcodinggap較其他序列具有更明顯的優(yōu)勢，其種鑒定成功率相對較高(83.3％)。因此，ITS是適合鬼臼亞科植物鑒別最好的DNA條形碼。
　　4)云南八角蓮和八角蓮的比較轉(zhuǎn)錄組
　　通過Hiseq2000測序平臺，對高海拔的云南八角蓮和低海拔的八角蓮進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，運用de

14、novo從頭組裝的方法，分別獲得了53929和44855條unigenes;基于序列相似性，我們找出兩個種的直系同源基因(Orthologs)為4593對，其中3126對直系同源基因有Ka/Ks值，Ka/Ks＞1的同源基因有202對，0.5＜ Ka/Ks＜1的同源基因有535對，這737對同源基因只有一對具有顯著P值（glycosyltransferase gene，Ka/Ks=0.606，P=0.02）。1273對表現(xiàn)出顯著的凈化選擇

15、(Ka/Ks＜0.5，P＜0.05)。另外，4593直系同源基因共含有SSR461個，其中，去除長度小于16bp的、側(cè)翼序列不足夠長的同源基因，最終成功設(shè)計了51對EST-SSR引物。我們檢驗了這些引物的通用性，其中26對(51％)和41對(80.4％)分別在鬼臼亞科和八角蓮屬具有通用性。最后，我們利用PCR直接擴增的方法得到了鬼臼亞科12個種33樣本的19個CYP719A（鬼臼毒素合成路徑的關(guān)鍵基因）的基因序列，并分析了它們的分子進(jìn)化

16、式樣，結(jié)果闡明了CYP719A基因在鬼臼亞科經(jīng)歷了強烈的凈化選擇，在八角蓮屬內(nèi)表現(xiàn)為分布海拔較高的物種具有松散的凈化選擇（relaxed purifying selection）或較強的正向選擇(more positive selection)。比較轉(zhuǎn)錄組研究為后續(xù)八角蓮屬物種及其近緣物種的群體遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)研究提供了大量的分子標(biāo)記。
　　綜上所述，鬼臼亞科是一個單系，山荷葉屬為基部類群，北美山荷葉與日本山荷葉成姐妹關(guān)系，八角