細菌中一種黃素依賴型單加氧酶的克隆表達及催化機制研究.pdf

1、黃素依賴型單加氧酶（FMO，E.C.1.14.13.8）是除了細胞色素P450（CYP450，E.C.1.14.14.1）之外，人類代謝系統(tǒng)中最重要的單加氧酶系統(tǒng)之一，它與外源物的代謝及毒物的多種應(yīng)答有關(guān)。與真核生物的基因組中的FMO相比，細菌的FMO相對稀少，僅僅鑒定到一些典型的FMO。原核生物中第一種鑒定過的FMO蛋白（bFMO）來自噬甲基菌SK1（Methylophaga sp.strain SK1）中，得到可溶性FMO蛋白的X射

2、線結(jié)構(gòu)能夠在2.6埃的分辨率上得以呈現(xiàn)。
　　所有哺乳動物的FMO對細胞膜都有著很強的結(jié)合，且蛋白水溶性很低，而目前為止沒有得到過任何哺乳動物的FMO晶體結(jié)構(gòu)。細菌中的FMO則不存在此類問題，從而更適合于實際應(yīng)用。又因其區(qū)域選擇和手性催化，以及穩(wěn)定性好等特點，在異源生物質(zhì)代謝、藥代動力學(xué)和生物催化合成等領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。
　　本課題從原油污染的土壤樣品中建立宏基因組文庫，分離到一種能使吲哚變藍的轉(zhuǎn)化子，我們將此功能的fm

3、o基因命名為bfmoⅡ。生物信息學(xué)分析表明，bFMOⅡ與之前研究過的bFMO存在著許多差異性，體現(xiàn)在密碼子的使用偏好性不同等。序列比對表明，bFMOⅡ的許多結(jié)構(gòu)與已結(jié)晶過的FMO蛋白有著很大相似性。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，證實了原核生物中FMO存在的多樣性，這為以后相應(yīng)研究的進一步開展打下了基礎(chǔ)。
　　通過將基因連入克隆載體pMD18-T，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，能將LB培養(yǎng)基中由宿主菌代謝生成的吲哚，進一步轉(zhuǎn)化成生物靛藍，并對生物靛藍產(chǎn)

4、量做了初步測定；通過將基因連入載體pET-28a，導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3)中，能將吲哚及吲哚類衍生物轉(zhuǎn)化成不同色素，為之前未曾證實過的。
　　本研究建立了一套完整的bFMOⅡ蛋白誘導(dǎo)表達及純化的方案。在通過對bFMOⅡ蛋白誘導(dǎo)條件的選擇，確定了以含質(zhì)粒pET-28a-FMO的大腸桿菌BL21（DE3）的酶表達體系。優(yōu)化了誘導(dǎo)表達條件，實驗選擇了低溫誘導(dǎo)（16℃），低濃度的誘導(dǎo)物（終濃度為0.3 mM IPTG），溫和的表達

5、環(huán)境（130 rpm），經(jīng)過對誘導(dǎo)后菌體細胞的破壁，得到了大量的可溶性蛋白，為后續(xù)蛋白的純化打下了基礎(chǔ)。在酶的分離純化過程中，通過實驗摸索，發(fā)現(xiàn)了硫酸銨沉淀為酶純化過程的關(guān)鍵。通過硫酸銨沉淀，將破壁后的粗酶液中的bFMOⅡ蛋白進行了初步的捕獲，得到了滿意的實驗結(jié)果，獲得了均質(zhì)的bFMOⅡ。
　　對純化后的bFMOⅡ的基本性質(zhì)進行了研究。通過非變性凝膠電泳得知bFMOⅡ活性狀態(tài)下，分子量大小約為110 kDa，為同型二聚體，單體分子

6、量約為55 kDa。通過對酶純化過程中的顏色及對純酶的全波長掃描，發(fā)現(xiàn)bFMOⅡ內(nèi)含有非共價結(jié)合的輔因子FAD，且在純化過程中容易丟失。通過bFMOⅡ的輔因子定量分析得知，酶中的一個亞基需要結(jié)合一個輔因子FAD。
　　對bFMOⅡ設(shè)計了四個可能存在的關(guān)鍵位點，并進行了點突變及活性驗證。通過觀察突變體對吲哚轉(zhuǎn)化的直接影響，確立了快捷的突變體活性檢測方法。結(jié)果說明，實驗所設(shè)計的四個位點相對應(yīng)的氨基酸殘基，對bFMOⅡ的活性起著重要的活