中低頻純音強(qiáng)聲對(duì)小型豬生物效應(yīng)的研究.pdf

1、背景:高聲壓級(jí)的可聽聲首先直接作用于聽覺系統(tǒng)，然后通過聽覺器官再作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且隨著暴露時(shí)間的延長，會(huì)引起一系列繼發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。對(duì)于強(qiáng)聲暴露引起的神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂和損傷，目前的研究結(jié)論多建立在強(qiáng)噪聲暴露的臨床經(jīng)歷和嚙齒類動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上。而對(duì)于純音強(qiáng)聲、尤其是中低頻純音強(qiáng)聲的生物效應(yīng)尚研究較少。就強(qiáng)聲暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)理而言，目前的研究主要集中在腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)受體的合成、釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面。對(duì)于影響腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)和

2、相關(guān)受體的機(jī)制研究較少，參與介導(dǎo)的信號(hào)通路尚未明確闡明。海馬和皮層的神經(jīng)元突觸,如果長時(shí)間維持增強(qiáng)的誘導(dǎo)、可導(dǎo)致突觸敏感化，引起神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，從而影響正常的神經(jīng)系統(tǒng)的功能。其最為突出的表現(xiàn)是空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降，但是目前強(qiáng)聲暴露對(duì)海馬和皮層神經(jīng)元遞質(zhì)及受體的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本課題以巴馬小型豬為研究對(duì)象，系統(tǒng)的觀察了中低頻純音強(qiáng)聲暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特點(diǎn)，并初步探討了強(qiáng)聲可能致海馬和皮層神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制，為進(jìn)一步

3、闡述強(qiáng)聲致神經(jīng)損傷的相關(guān)機(jī)理提供了參考。
　　材料和方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以巴馬小型豬作為研究對(duì)象。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件相同。30只巴馬小型豬隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組，900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露組和900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組?？瞻讓?duì)照組小型豬不進(jìn)入強(qiáng)聲實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場；130 dB強(qiáng)聲暴露組采用900 Hz、130 dB強(qiáng)聲刺激15 min；142 dB組采用900 Hz、142 dB強(qiáng)聲刺激1

4、5 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)抽取小型豬5只，麻醉后抽取靜脈血10 ml，獲取血液后將其處死，取出相同部位的部分海馬和皮層組織，分別存放于液氮和4％的福爾馬林溶液中。每組剩余的小型豬送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心留觀，一周后同法取樣。
　　1、血清生化分析：獲得的靜脈血凝血后2000 rpm室溫離心10 min，取上層血清，使用全自動(dòng)血液分析儀對(duì)小型豬各血清樣品生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，檢測內(nèi)容包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、肌酸

5、激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、γ-羥丁酸脫氫酶（γ-HBDH）、總膽汁酸（TBA）、超氧化物歧化酶（SOD）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨肽酶（LAP）等。
　　2、血清神經(jīng)內(nèi)分泌激素分析：獲得的血清，按照相應(yīng)激素的檢測試劑盒說明書提供的實(shí)驗(yàn)步驟，采用ELISA方法對(duì)血清中不同激素的含量進(jìn)行檢測。檢測的激素包括促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、血清皮質(zhì)醇（CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋

6、放激素（CRH）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、去甲腎上腺素（NE）、腦紅蛋白（NGB）、神經(jīng)肽P（NPP）、神經(jīng)肽Y（NPY）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、血清S100-b等。
　　3、腦組織形態(tài)學(xué)觀察：將固定后的組織樣品依次進(jìn)行梯度脫水、石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度4μm，切片后進(jìn)行HE染色，封片后于顯微鏡下觀察并拍照。
　　4、鈣離子濃度分析：OTC包埋組織，冰凍切片機(jī)切片，加入Fluo-4進(jìn)行染色、孵育并清洗后，在

7、激光共聚焦顯微鏡下觀察鈣離子的熒光信號(hào)，使用ZEN2011軟件對(duì)鈣離子濃度進(jìn)行定量分析。
　　5、基因mRNA表達(dá)水平檢測：液氮中冷凍組織經(jīng)研磨后使用Qiagen試劑盒提取總的mRNA，總RNA定量后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；針對(duì)PKC、PI3K和CACNA2D1基因，選用合適的引物，采用Real-time PCR方法定量分析上述基因表達(dá)水平。
　　6、PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測：將液氮中凍存冷凍的組織充分裂解后，提取組

8、織蛋白，然后進(jìn)行蛋白電泳和蛋白轉(zhuǎn)印。PKC和Ca2+受體特異的抗體4℃孵育過夜，洗膜后，二抗室溫孵育60 min，最后進(jìn)行暗室顯影，對(duì)PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:巴馬小型豬分別暴露在900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低頻純音強(qiáng)聲條件下15分鐘后均出現(xiàn)明顯的行為異常，表現(xiàn)為：小型豬大部分采取背對(duì)強(qiáng)聲發(fā)生裝置的姿勢，出現(xiàn)興奮性增強(qiáng)，局促不安，撞籠等現(xiàn)象，個(gè)別小豬出現(xiàn)了小便失禁,無法

9、自主站立或前肢跪下等行為異常反應(yīng)，對(duì)銳器刺激反應(yīng)不敏感。以上異常行為提示有神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
　　900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后和暴露后一周血清指標(biāo)顯示：（1）血清中SOD的含量都明顯增加；血清中CK含量都明顯下降；（2）血清中CRP含量都明顯上升，而血清中NE和LDH、CK-MB、ALP、γ-HBDH含量都明顯下降；（3）900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后血清中CORT和α-HBD

10、H含量下降；900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后血清中NSE含量升高，血清中（γ-GT）含量下降；（4）900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露一周后血清中NPY和TBA含量上升；此外，短時(shí)間的強(qiáng)聲暴露對(duì)血清中ACTH、CRH、NGB、NPP、S100-β、LAP的含量沒有明顯的影響。以上結(jié)果提示SOD、NSE和CK有可能作為強(qiáng)聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。
　　小型豬腦組織形態(tài)學(xué)分析：海馬組織HE染色顯示：900 Hz-130 d

11、B強(qiáng)聲暴露組未見明顯損傷樣改變，900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組可見海馬組織出現(xiàn)明顯的損傷樣改變，部分顆粒細(xì)胞核明顯固縮，細(xì)胞質(zhì)空泡化，椎體細(xì)胞水腫較為明顯，提示這部分細(xì)胞可能已經(jīng)凋亡。
　　小型豬腦組織中鈣離子濃度的定量分析顯示：與空白對(duì)照組相比，900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組可見海馬組織中鈣離子濃度明顯增加，而在皮層組織中，鈣離子濃度明顯下降。
　　小型豬腦組織中PKC、PI3K和CACNA2D1基因mRNA表

12、達(dá)水平檢測：與空白對(duì)照組相比，900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組海馬組織中PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯上調(diào)；而在皮層組織中，強(qiáng)聲暴露后PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　小型豬腦組織中PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測：與空白對(duì)照組相比，900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組的海馬組織中，PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯增加；而在皮層組織中，PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯下降。

13、>　　結(jié)論:綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低頻純音強(qiáng)聲暴露15分鐘后，小型豬出現(xiàn)異常行為反應(yīng)。900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露組可見血清中部分生化分子和神經(jīng)內(nèi)分泌激素發(fā)生不同程度的變化，其中NSE和SOD明顯升高、CK含量明顯下降，提示SOD、NSE和CK有可能作為強(qiáng)聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。900 Hz-142 dB短時(shí)間的強(qiáng)聲刺激可引起大腦海馬組織損傷樣改