甲苯脅迫對填埋場覆蓋土中CH4氧化的影響及機理研究.pdf

1、填埋場覆蓋土層是填埋垃圾與大氣體系的環(huán)境界面，在減排填埋場溫室氣體CH4中扮演著重要的角色。填埋氣（landfill gas，LFG）是一種混合氣體，除了主要成分CH4和CO2外，還含有非CH4類揮發(fā)性有機物（non-methane volatile organic compounds，NMVOCs）。雖然LFG中NMVOCs的體積含量不足1％，但其中含有許多“三致”物質(zhì)，如苯、甲苯、三氯乙烯等，對覆蓋土層中微生物的生長和活性有著重要的

2、影響。同時，一些甲烷氧化菌不僅能夠氧化CH4，而且具有共代謝或氧化部分烷烴、烯烴、鹵代烴及芳香族化合物的能力。因此，研究NMVOCs共存下覆蓋土中CH4氧化活性的響應(yīng)特征和機理，這對于減少填埋場CH4和NMVOCs排放具有重要的意義。鑒于此，本論文以甲苯為LFG中NMVOCs的代表化合物，以常規(guī)的填埋場覆蓋土(landfill cover soil，LCS)和垃圾生物覆蓋土(wastebiocover soil，WBS)等為材料，采用分

3、子生物學(xué)技術(shù)，包括實時定量PCR(real-timequantitative PCR，qPCR)、克隆、末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（terminal restrictionfragment length polymorphism，T-RFLP）、穩(wěn)定性同位素探針（stable isotope probing，SIP）等，研究了填埋場覆蓋土層中CH4與甲苯代謝的功能菌群，解析了甲苯脅迫下甲烷氧化菌的生長、CH4氧化活性、CH4-C分

4、配及功能基因表達(dá)的響應(yīng)特征;同時采用填埋場覆蓋土模擬土柱，探究了CH4和甲苯在覆蓋土層中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，建立了覆蓋土層中CH4和甲苯排放的解析模型。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)分別以CH4、甲苯、CH4和甲苯為唯一碳源，探究了甲苯脅迫對CH4富集培養(yǎng)物的活性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)與CH4或甲苯為碳源的富集培養(yǎng)物相比，CH4和甲苯共存體系中微生物受到較大的環(huán)境壓力，其中微生物分泌了較多的胞外多糖和胞外蛋白，進(jìn)而對其CH4和甲

5、苯的代謝活性形成抑制;同時，CH4和甲苯的共存對富集培養(yǎng)物中微生物具有較高的選擇性，可降低體系中微生物的多樣性。Methylosinus是CH4和甲苯共存體系中的優(yōu)勢甲烷氧化菌。
　　(2)以Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus sporium為模式菌株，研究了甲苯脅迫對甲烷氧化菌的生長、活性及其功能基因(pmoA和mmoX)表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)低濃度甲苯(≤300 mgm-3)對Methylosinus sporium的生長和CH

6、4氧化活性無明顯影響;當(dāng)甲苯濃度大于2000 mgm-3時，其生長和活性受到抑制;當(dāng)甲苯濃度大于80000 mg m-3時，Methylosinus sporium的生長和CH4氧化活性受到完全抑制。Methylosinus sporium表達(dá)的sMMO數(shù)量可在1000mg m-3甲苯短期脅迫(～40 h)下顯著增加，并在一定程度上對其CH4氧化產(chǎn)生了促進(jìn)作用。分子對接計算和甲苯代謝中間產(chǎn)物的測定結(jié)果表明甲苯可主要通過疏水作用和靜電作用

7、結(jié)合于sMMO活性區(qū)域，進(jìn)而被直接氧化為鄰甲酚。
　　(3)以LCS為對照，探討了甲苯脅迫對WBS的CH4氧化活性及其甲烷氧化菌種群結(jié)構(gòu)的影響。初始甲苯濃度≤4000 mg m-3對WBS的CH4氧化具有促進(jìn)作用，但初始甲苯濃度100 mg m-3時，即可對LCS的CH4氧化產(chǎn)生抑制作用;完全抑制WBS CH4氧化的甲苯濃度為80000 mg m-3，比LCS約高10倍。在CH4、O2和甲苯初始濃度分別為10％、21％和50～20

8、00 mg m-3的長期(61d)暴露下，WBS的CH4氧化活性顯著高于LCS。但≥1000mg m-3甲苯濃度的長期(～50d)暴露可顯著抑制WBS的CH4氧化。
　　暴露于CH4和甲苯后，覆蓋土中甲烷氧化菌的數(shù)量出現(xiàn)了增長，其中WBS中甲烷氧化菌的數(shù)量比LCS高1～2個數(shù)量級。在初期(14 d)，甲苯(50～2000mgm-3)和CH4的共暴露可顯著增加WBS中甲烷氧化菌的數(shù)量;但到后期(61 d)，甲苯為2000 mg m-

9、3組中甲烷氧化菌的數(shù)量出現(xiàn)了顯著的下降。Ⅰ型甲烷氧化菌Methylocaldum、Methylobacter和Methylococcaceae和Ⅱ型甲烷Methylocystis和/或Methylosinus是實驗覆蓋土中主要的甲烷氧化菌，WBS以Methylocaldum為主，而在LCS中則以Methylocystis和/或Methylosinus為主。與Methylocystis和/或Methylosinus相比，Methyloca

10、ldum對甲苯和/或其毒性代謝中間物較為敏感。
　　(4)采用覆蓋土SIP微生境，研究了在不同氧濃度下甲苯脅迫對覆蓋土CH4-C分配及其代謝微生物的影響。發(fā)現(xiàn)低O2濃度(2.5％)和甲苯脅迫可促進(jìn)覆蓋土中CH4-C向有機質(zhì)-C和生物量-C的轉(zhuǎn)化，提高碳的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而有效促進(jìn)了覆蓋土中微生物的生長。
　　實驗覆蓋土中主要的微生物為Proteobacteria和Bacteroidetes。與高O2濃度相比，低O2濃度下甲苯脅迫對

11、覆蓋土中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大。實驗覆蓋土中參與CH4-C代謝的主要微生物屬于Proterbacteria、Gemmatimonadetes和Firmicutes。其中，主要活躍的甲烷氧化菌為Ⅰ型甲烷氧化菌Methylobacter、Methylocaldum、Methylosarcina和Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus，其中，以Ⅰ型甲烷氧化菌為主。
　　(5)采用模擬填埋場覆蓋土土柱，探究了覆蓋土層中CH4和甲苯的遷移

12、轉(zhuǎn)化規(guī)律及其去除機理。發(fā)現(xiàn)當(dāng)模擬LFG進(jìn)氣速率為1.6 m3 m-2 d-1，甲苯濃度為0～1336 mg m-3時，WBS和LCS土柱對模擬LFG中CH4的去除率分別為45.4％～73.4％和22.9％～29.6％，甲苯的去除率分別為98.7％～100％和96.9％～98.1％。當(dāng)甲苯濃度為～1336 mg m-3時，WBS和LCS土柱的CH4氧化活性均受到明顯的抑制，其中，WBS具有更強的相對抑制效應(yīng)。甲苯在覆蓋土層深層（＞21 c