植物微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(P-MITE)的構(gòu)建和煙草中TMV侵染后無癥狀表型控制基因的遺傳克隆.pdf

1、本文研究內(nèi)容包括三個部分，下面將分別從三個部分進(jìn)行論述:
　　1、植物中微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(P-MITE)的構(gòu)建
　　微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子(miniature inverted-repeat transposable element, MITE)是一類長度較短的非自主型轉(zhuǎn)座子，具有DNA轉(zhuǎn)座子相似的結(jié)構(gòu)，如末端反向重復(fù)(terminal inverted repeats，TIR)和正向序列重復(fù)(target site d

2、uplication, TSD)。與DNA轉(zhuǎn)座子不同，MITE在基因組中有很高的拷貝，傾向于插入基因內(nèi)或基因附近。MITE與基因的高度相關(guān)性可能預(yù)示著MITE在基因的調(diào)控中有著重要作用，可能是基因組進(jìn)化和物種分化的動力之一。雖然關(guān)于MITE的研究有諸多報道，但由于缺乏各物種全基因組的MTIE信息和可以數(shù)據(jù)共享的平臺，MITE的研究相對遲緩，特別是MITE的大規(guī)模組學(xué)分析。本研究中，我們利用軟件MITE Digger、MITE-Hunte

3、r和我們實驗室自己開發(fā)的程序RSPB從41個已經(jīng)測序的植物基因組中從頭鑒定MITE。對于每一個MITE家族，我們至少手工鑒定了1條種子序列，來確保MITE鑒定的可靠性。包括之前在水稻中鑒定的MITE序列，我們一共得到了3，527個MITE家族，共計2，332，901條MITE序列。不同物種中MITE家族和拷貝數(shù)都不同，總體而言高等植物中具有更多數(shù)量的MITE。物種MITE數(shù)量的大小與物種基因組大小正相關(guān)，表明MITE在基因組的進(jìn)化中起著

4、一定的作用。我們從水稻、玉米、小米和馬鈴薯基因中共發(fā)現(xiàn)了10個具有潛在跳躍活性的MITE組，每組均含有至少20個相同的MITE拷貝。為了方便MITE的研究，我們構(gòu)建了MITE數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(P-MITE，網(wǎng)址為http://pmite.hzau.edu.cn/，)，用以存儲本研究中產(chǎn)生的所有MITE數(shù)據(jù)，并在P-MITE數(shù)據(jù)庫中提供了序列瀏覽、檢索、BLAST和下載等功能。P-MITE平臺的搭建將有利于促進(jìn)人們對MITE起源、MITE擴(kuò)增和

5、MITE對基因的調(diào)控方式等方面的研究。
　　2、結(jié)合RNA-seq和BSA進(jìn)行基因遺傳定位的方法開發(fā)
　　混合池分組分析法(Bulk segregant analysis，BSA)是一種可以快速找到與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記的方法。將第二代測序和RNA-seq測序技術(shù)結(jié)合起來，可以快速找到與目的表型相關(guān)的基因組區(qū)域。目前已有多種方法可以用來進(jìn)行BSARNA的分析，但這些方法的應(yīng)用需要被研究物種有較好的參考基因組。本研究中，我們

6、開發(fā)了一個利用BSARNA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的方法，snpMapper，并將該方法應(yīng)用到3個不同群體的BSARNA數(shù)據(jù)分析中。結(jié)果表明，snpMapper均可以在3個數(shù)據(jù)集中找到與目標(biāo)基因相關(guān)的染色體區(qū)段，在沒有較好參考基因組的情況下，snpMapper也可以找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotidepolymorphism，SNP）。因此，snpMapper是一個有效的BSA RNA-seq數(shù)據(jù)分析方法。

7、
　　3、煙草中控制TMV侵染后產(chǎn)生無癥狀表型的基因的定位和克隆
　　病毒在宿主體內(nèi)的有效復(fù)制需要宿主提供合適的因子。盡管在過去的研究中報道了諸多植物體內(nèi)參與病毒復(fù)制的宿主因子，但煙草中此類參與煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)復(fù)制的宿主因子沒有報道。本研究中，我們通過圖位克隆的方法在四倍體煙草中克隆到了2個參與煙草花葉病毒TMV-U1株系互作的宿主因子:NtTOM2A-Ntom和NtTOM2A

8、-Nsyl。遺傳分析發(fā)現(xiàn)這2個基因是分別位于2個亞基因組上的同源基因(homoeologous gene)。2個基因同時發(fā)生突變，使得TMV病毒在煙草中的積累量大幅度下降，從而導(dǎo)致了symptomless表型。熒光定量PCR(qRT-PCR)分析發(fā)現(xiàn)，NtTOM2A在煙草不同組織中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)水平略高，在接種病毒前后表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化。我們通過標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建了NtTOM2A-Nsyl的一個近等基因系，并對近等基因系及對照