不同時(shí)期蛛網(wǎng)膜下腔出血時(shí)活體腦片鈣離子的變化.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage)在臨床上主要是因顱內(nèi)病變血管破裂，大量血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔引起腦組織受損的臨床綜合征。腦血管痙攣(Cerebral vasospasm，CVS)是 SAH后一系列并發(fā)癥之一，發(fā)作常見(jiàn)且后果嚴(yán)重。CVS根據(jù)發(fā)作時(shí)間可分為早發(fā)性和遲發(fā)性。早發(fā)性CVS，是指在SAH后3天內(nèi)發(fā)作的腦血管痙攣。然而，這種CVS發(fā)作時(shí)間較短，且?guī)?lái)的腦損傷是可逆轉(zhuǎn)的，故在臨床中不容易發(fā)現(xiàn)。遲發(fā)性腦血管痙

2、攣(Delayed cerebral vasospasm，DCVS)相比則更嚴(yán)重，其發(fā)作時(shí)間在72h后，它造成的腦損傷是難以逆轉(zhuǎn)的，損傷更嚴(yán)重，致死致殘率更高。若是想降低 SAH后的致死致殘率，最重要的是將 SAH后的CVS控制在早期的可逆性損傷，防止其進(jìn)一步發(fā)展為不可逆的DCVS。
　　鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，廣泛而精細(xì)的調(diào)節(jié)著神經(jīng)細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)傳導(dǎo)。SAH后血管壁細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度存在變化,這表明了在 SAH后

3、鈣離子動(dòng)態(tài)平衡出現(xiàn)了紊亂。SAH后具體的離子失衡機(jī)制尚不十分明確,然而許多因素，例如炎性因子的激活，自由基的活化和缺氧誘導(dǎo)等已被證明在 SAH后可改變鈣通道的表達(dá)，引起胞內(nèi)鈣失衡。
　　目的：
　　通過(guò)線栓穿刺法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，結(jié)合雙光子顯微鏡活體成像技術(shù)和 Fluo4-AM鈣離子染色劑，在顯示器上動(dòng)態(tài)觀察造模大鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度變化。雙光子顯微鏡下熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即反映了鈣離子失衡的程度。通過(guò)研究鈣離子失

4、衡曲線，解釋臨床 SAH后CVS雙向性的某些機(jī)制，為臨床不同時(shí)期應(yīng)用鈣離子拮抗劑提供理論指導(dǎo)。
　　方法：
　　1健康的育齡3-6個(gè)月50只SD雄性大鼠，體重控制在270-330g。將50只大鼠隨機(jī)分組，正常組大鼠共5只，假手術(shù)組大鼠共5只，手術(shù)造模組大鼠共40只，按造模后開(kāi)顱順序依次分為術(shù)后3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d組共8組，每組大鼠共5只。手術(shù)組行經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈血
　　管內(nèi)穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下

5、腔出血模型，空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，假手術(shù)組不刺破大腦中動(dòng)脈與前動(dòng)脈分叉處直接拔出，剩余操作同手術(shù)組。
　　2大鼠清醒后于術(shù)后24h進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為Garcia法。記錄大鼠評(píng)分表現(xiàn)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3神經(jīng)學(xué)評(píng)分完畢后快速斷頭取腦，對(duì)各組鼠腦進(jìn)行大體組織形態(tài)學(xué)觀察。拍照后保持腦組織活性連續(xù)震蕩切片，切片完畢后用 Fluo4-AM進(jìn)行熒光染色。將染色過(guò)的腦片完整置入 TPLSM的物鏡下觀測(cè)槽內(nèi)，拍照并記錄不

6、同組腦片同一部位的鈣離子分布情況差異，并用相關(guān)軟件(LAS AF Lite)分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。
　　4統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析使用SPSS21.0軟件。各組數(shù)據(jù)平均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一腦區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)比較及同一時(shí)間點(diǎn)不同腦區(qū)比較均采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，各組間互相比較采用SNK-T檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05時(shí)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后神經(jīng)學(xué)評(píng)分手術(shù)組大鼠出現(xiàn)一系

7、列陽(yáng)性表現(xiàn)。假手術(shù)組上述表現(xiàn)均為陰性。且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2各組腦組織出血大體觀察正常組及假手術(shù)組：未見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，大腦半球無(wú)水腫。術(shù)后3h：蛛網(wǎng)膜下腔彌漫出血，色鮮紅，量較大，大腦無(wú)水腫。術(shù)后6h：蛛網(wǎng)膜下腔彌漫出血，出血范圍較前增大，色鮮紅，大腦無(wú)水腫。術(shù)后12h：蛛網(wǎng)膜下腔彌漫出血，出血范圍較前增大，色較前暗紅，術(shù)側(cè)大腦半球可見(jiàn)水腫。術(shù)后24h：蛛網(wǎng)膜下腔彌漫出血，出血范圍較前無(wú)明顯變化，色較前暗紅，術(shù)側(cè)大腦半球可見(jiàn)

8、水腫。術(shù)后48h：蛛網(wǎng)膜下腔的血液凝結(jié)成塊，成暗紅色，壓迫腦干，術(shù)側(cè)大腦半球可見(jiàn)水腫。術(shù)后72h：蛛網(wǎng)膜下腔出血較前減少，偶見(jiàn)血凝塊，術(shù)側(cè)大腦半球可見(jiàn)水腫。術(shù)后5d組：蛛網(wǎng)膜下腔出血基本吸收完畢，偶見(jiàn)Willis環(huán)有少量暗紅色血塊包裹。術(shù)后7d組：蛛網(wǎng)膜下腔血液基本消失。
　　3鈣離子在大鼠各腦區(qū)中分布的變化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析3h組：皮質(zhì)的[Ca2+]i顯著高于皮質(zhì)下和髓質(zhì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。6h組：皮質(zhì)的[Ca2+]i明顯

9、高于皮質(zhì)下和髓質(zhì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。12h組：皮質(zhì)[Ca2+]i>皮質(zhì)下[Ca2+]i>髓質(zhì)[Ca2+]i，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。24h組：皮質(zhì)[Ca2+]i>皮質(zhì)下[Ca2+]i>髓質(zhì)[Ca2+]i，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。48h 組：皮質(zhì)下[Ca2+]i>皮質(zhì)[Ca2+]i>髓質(zhì)[Ca2+]i，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。72h組：皮質(zhì)下[Ca2+]i>皮質(zhì)[Ca2+]i>髓質(zhì)[Ca2+

10、]i，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。5d組：皮質(zhì)下[Ca2+]i>皮質(zhì)[Ca2+]i>髓質(zhì)[Ca2+]i，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。7d組：皮質(zhì)下[Ca2+]i高于皮質(zhì)和髓質(zhì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1本實(shí)驗(yàn)采用了大鼠經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈血管內(nèi)插線模型，此方法手術(shù)操作創(chuàng)傷小，可重復(fù)性好，較為完美的模擬了臨床上前交通動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血，是目前 SAH造模的首選方法。
　　2 SAH后C

11、VS主要分兩個(gè)階段，SAH早期CVS在出血后15min-3h內(nèi)即可發(fā)生，主要因致痙因子、炎性因子等導(dǎo)致血管平滑肌持續(xù)性痙攣，而 DCVS多在 SAH后48-72h開(kāi)始發(fā)生，主要因長(zhǎng)期缺氧導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡導(dǎo)致。雙光子熒光顯微鏡下皮質(zhì)鈣離子在 CVS急性期熒光強(qiáng)度持續(xù)性上升，直至72h最高峰，之后熒光強(qiáng)度開(kāi)始下降。本實(shí)驗(yàn)大鼠腦內(nèi)鈣離子超載的雙向性與臨床 CVS雙向性基本一致。
　　3 SAH后皮質(zhì)鈣離子熒光強(qiáng)度在各時(shí)間點(diǎn)均高于髓質(zhì)，