心臟干細胞年齡、性別及部位分布特征研究.pdf

1、背景：
　　心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于為心臟供血的冠狀動脈堵塞，而導(dǎo)致心肌細胞缺血壞死的一種嚴(yán)重危害人類健康的高風(fēng)險、高死亡的疾病。目前針對心肌梗死的治療主要包括：藥物治療、介入治療以及外科冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，但是這些治療方法均僅僅能夠起到恢復(fù)局部心肌的血液供應(yīng)，延緩心肌梗死后不利的心肌重塑的作用，而并不能從根本上解決心肌梗死后心肌數(shù)目減少、心臟功能進行性下降這一心肌梗死后的根本問題。我們及

2、他人的研究表明，心臟中存在著心臟干細胞（cardiac stem cells，CSCs），它可以分化成心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等，并可以修復(fù)損傷的心肌組織。本研究擬從基礎(chǔ)性研究角度觀察小鼠心臟干細胞各亞群的年齡分布及性別分布情況，同時對各干細胞亞群在心臟不同部位中的分布情況進行初步檢測，為臨床干細胞治療心肌梗死尋找新的靶點。
　　目的：
　　本研究擬從基礎(chǔ)性研究角度觀察小鼠心臟干細胞各亞群的年齡分布及性別分布情況，

3、同時對各干細胞亞群在心臟不同部位中的分布情況進行初步檢測，為臨床干細胞治療心肌梗死尋找新的靶點。
　　方法：
　　1、利用免疫磁珠活性分選法獲得的C57小鼠心臟干細胞，并利用流式細胞儀進行細胞純度鑒定；對分選的心臟干細胞行細胞培養(yǎng)并觀察其定向分化的能力。
　　2、利用流式細胞技術(shù)分析4周齡青年C57小鼠與9月齡老年C57小鼠各9只心臟干細胞的含量；分析6月齡健康成年雌性、雄性各9只C57小鼠心臟干細胞的含量；分析9只6

4、月齡健康成年C57小鼠心房、左心室、右心室以及室間隔的心臟干細胞含量。
　　結(jié)果：
　　1 C57小鼠心臟干細胞的活性分選及鑒定
　　1.1磁珠分選法獲得的C57小鼠CD45-、Sca-1+干細胞流式細胞儀純度鑒定
　　Lagendorff裝置灌流、消化酶解心肌細胞，經(jīng)30μm濾網(wǎng)過濾后的小細胞，經(jīng)Sca-1及CD45抗體孵育后，用流式細胞儀檢測CD45-、Sca-1+細胞百分比。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，純化后的CD45-、

5、Sca-1+細胞百分比高達86.4％，細胞純化技術(shù)穩(wěn)定。
　　1.2分離培養(yǎng)的心臟干細胞具有多向分化能力
　　從正常6月齡成年雄性C57小鼠心臟中分離、提取心臟干細胞，培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，然后固定細胞進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)：干細胞已向特定細胞類型開始分化。分別用肌鈣蛋白（troponin I，紅色）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，紅色）、von Willebrand因子（vWF，

6、綠色）作為心肌細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞的標(biāo)記物（細胞核用DAPI標(biāo)記為藍色），見圖。證明分離培養(yǎng)的心臟干細胞確實具有定向分化為心臟組織細胞的能力，即分離的心臟干細胞成功。
　　2 C57小鼠心臟干細胞的年齡、性別及部位分布
　　2.1 C57小鼠ckit+心臟干細胞與sca-1+心臟干細胞含量比較
　　選擇6月齡成年雄性C57小鼠9只，分別使用流式細胞技術(shù)測定其心臟中ckit+心臟干細胞與sca-1+心臟干細胞含量（

7、%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ckit+CSCs含量明顯少于sca-1+CSCS含量。（0.19±0.027 vs21.37±3.378，P＜0.05）。
　　2.2不同年齡C57小鼠ckit+、sca-1+心臟干細胞含量比較
　　選擇4周齡和9月齡的雄性C57小鼠各9只，分別作為青年組和老年組，使用流式細胞技術(shù)測定其心臟中ckit+心臟干細胞與sca-1+心臟干細胞含量（%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)青年組ckit+心臟干細胞含量（%）多于老年組（0.2

8、4±0.036 vs0.16±0.057，P＜0.05）；而老年組sca-1+心臟干細胞含量（%）明顯多于青年組（25.41±4.689 vs20.41±5.213，P＜0.05）；由于sca-1+心臟干細胞含量明顯高于ckit+心臟干細胞，所以總體來說老年組心臟干細胞含量（%）明顯高于青年組（23.67±6.431 vs20.21±3.452，P＜0.05）。
　　2.3不同性別C57小鼠ckit+、sca-1+心臟干細胞含量比

9、較
　　選擇6月齡成年C57小鼠雌雄各9只，分別作為雌性組和雄性組，使用流式細胞技術(shù)測定其心臟中ckit+心臟干細胞與sca-1+心臟干細胞含量（%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌性組ckit+心臟干細胞含量（%）與雄性組差別無統(tǒng)計學(xué)意義（0.19±0.034 vs0.18±0.045，P＞0.05）；同時雌性組sca-1+心臟干細胞含量（%）與雄性組差別亦無統(tǒng)計學(xué)意義（22.35±3.423 vs21.90±4.322，P＞0.05）；所以總體來

10、說雌性組及雄性組心臟干細胞含量顯著差異（21.37±6.231 vs20.21±2.322，P＞0.05）。
　　2.3 C57小鼠心臟不同部位ckit+、sca-1+心臟干細胞含量比較
　　選擇6月齡成年雄性C57小鼠9只，將其心臟分為心房，左心室，右心室，室間隔四個部分作為4組，分別使用流式細胞技術(shù)測定其心臟中ckit+心臟干細胞與sca-1+心臟干細胞含量（%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)心房組、左心室組、右心室組以及室間隔組，各組間c

11、kit+心臟干細胞含量（%）差別無統(tǒng)計學(xué)意義（0.19±0.034 vs0.18±0.045 vs0.19±0.028 vs0.18±0.087，P＞0.05）；同時心房組、左心室組、右心室組以及室間隔組，各組間sca-1+心臟干細胞含量（%）差別無統(tǒng)計學(xué)意義（23.25±5.313 vs22.89±3.322 vs21.98±4.577 vs22.65±3.373，P＞0.05）；所以，總體來說心房組、左心室組、右心室組以及室間隔組，

12、各組間心臟干細胞含量（%）差別無統(tǒng)計學(xué)意義（22.95±1.364 vs21.41±5.364 vs22.58±6.132 vs22.35±7.7313，P＞
　　0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．免疫磁珠分選法獲得的C57小鼠心臟干細胞具有多向分化為心肌細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞的的能力。
　　2． C57小鼠ckit+心臟干細胞含量明顯少于sca-1+心臟干細胞。
　　3．老年C57小鼠心臟干細胞含量明