游離二氧化硅誘導(dǎo)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞轉(zhuǎn)分化及其時間-效應(yīng)關(guān)系.pdf

1、背景和目的：
　　有關(guān)肝、腎等纖維化疾病的研究表明，肌成纖維細胞是分泌膠原纖維的主效應(yīng)細胞，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是其主要來源之一。矽肺的發(fā)病機制并不完全清楚，但已知矽肺的纖維化過程中，肌成纖維細胞同樣是合成、分泌膠原纖維的主效應(yīng)細胞。肌成纖維細胞的來源除了肺內(nèi)固有的成纖維細胞外，其他來源也同樣受到重視。肺泡Ⅱ型上皮細胞具有一定的分化能力，有可能是肌成纖維細胞的潛在來源之一。迄今為止，在矽肺過程中，二氧化硅（SiO2）粉塵如何誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型

2、上皮細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的機制、效率以及轉(zhuǎn)分化標志物的時間-效應(yīng)關(guān)系尚不確定。因此，本研究構(gòu)建了體外共培養(yǎng)模型和大鼠矽肺模型，應(yīng)用電子透射電鏡、實時熒光定量PCR、激光共聚焦成像、Western blot等實驗技術(shù)，探索體內(nèi)外肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生EMT的過程及其時間-效應(yīng)關(guān)系，為矽肺的機制闡釋提供了新的思路，為矽肺的監(jiān)測和干預(yù)提供了參考。
　　方法：
　　1.提取原代肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）和AM，購買肺泡Ⅱ型上皮細

3、胞株（RLE-6TN），并對AECⅡ和RLE-6TN進行電子透射鑒定。通過CCK-8實驗，用1~140μg/mL的SiO2濃度梯度染塵24、48和72h，確定染塵濃度。
　　2.建立體外共培養(yǎng)模型，AECⅡ細胞分為對照組和實驗組，RLE-6TN分為直接對照組、直接染塵組、間接對照組和間接染塵組。采用western blot和qRT-PCR技術(shù)測定不同分組24、48和72h時AECⅡ和RLE-6TN中GAPDH、E-cad和α-SM

4、A的蛋白和mRNA的相對表達水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)測定24、48和72h時AECⅡ、RLE-6TN的細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的含量。
　　3.建立大鼠矽肺模型，選擇SPF級4~6周齡的雄性健康SD大鼠84只，體重在160~180g之間，購于河南省實驗動物中心，通過非氣管暴露法進行 SiO2染塵，實驗分為對照組和染塵組，對照給予等量的生理鹽水，每組6只，并在實驗的1、2、3、4、6、9和12周時處死相應(yīng)的大鼠

5、。采用HE染色法判斷大鼠矽肺模型是否成功；采用激光共聚焦熒光雙染技術(shù)，檢測肺組織冰凍切片中E-cad和α-SMA的定位及表達水平，采用ELISA測定大鼠矽肺組織研磨液中TGF-β1的含量。
　　4.統(tǒng)計分析：采用SPSS21.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均值加減標準差（?±s）表示，雙因素數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析，單因素數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），均數(shù)的兩兩比較采用最

6、小顯著差法（LSD檢驗），檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.原代AECⅡ和RLE-6TN的電子透射電鏡顯示，細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)均可見特異性的板層小體。CCK-8測定SiO2對細胞抑制率顯示，同一染毒條件下隨著時間的延長，抑制作用越強，同一染塵時間時，隨著染塵濃度的增大抑制作用增強，約在最長染塵時間72h時抑制率達到50％，此時的SiO2濃度約為100μg/mL。
　　2.原代AECⅡ的實驗組和對照組相比，蛋白E-ca

7、d和α-SMA的相對表達水平的差異顯著（P<0.05），實驗組E-cad和α-SMA的相對表達水平隨著時間的延長呈現(xiàn)明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。實驗組和對照組培養(yǎng)細胞的上清液中TGF-β1的含量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并且實驗組TGF-β1的變化具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，其最大值為1.42ng/mL。
　　3.RLE-6TN細胞的直接染塵組與直接對照組、間接染塵組與間接對照組相比，E-cad和α-SMA的蛋白和mRNA水平

8、的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系；直接染塵組和間接染塵組均可使E-cad的蛋白和mRNA水平表達下降而α-SMA的表達上升，間接染塵組 E-cad下降和α-SMA上升的時間早于直接染塵組。細胞培養(yǎng)上清液中，TGF-β1的含量在直接染塵組與直接對照組、間接染塵組與間接對照組差異顯著（P<0.05），間接染塵組和直接染塵組中均具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，其最大值為1.81ng/mL。
　　4.HE染色顯

9、示，在2周時可見染塵組肺組織有明顯的炎性細胞聚集，3周時肌纖維逐漸減少，膠原纖維增多，特別是在3周以后，可見膠原纖維聚集成團，形成細胞性結(jié)節(jié)，6周有纖維性結(jié)節(jié)出現(xiàn)，之后結(jié)節(jié)逐漸增大融合，甚至出現(xiàn)肺間隔斷裂。染塵組肺組織研磨液中TGF-β1的含量在2周時達到最大值，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；免疫熒光雙染顯示對照組和實驗組在2周時E-cad的表達達到最大值，之后逐漸下降，而α-SMA呈現(xiàn)隨時間逐漸上升的趨勢。
　　結(jié)論：
　　游離