納米熒光探針用于細(xì)胞和活體中活性小分子和miRNA的高靈敏檢測(cè)與成像.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)的活性分子是細(xì)胞的重要組成成分，它主要分為兩類：活性小分子和活性大分子?；钚孕》肿又饕ɑ钚匝踝杂苫⒒钚缘杂苫?、氣體小分子（CO、NO、H2S、O2等）、抗氧化劑（谷胱甘肽和維生素C等）、H+、金屬陽離子、陰離子等；活性大分子包括蛋白質(zhì)和核苷酸等。這些活性分子在生物體的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，是活細(xì)胞生理功能必不可少的物質(zhì)。目前，細(xì)胞內(nèi)活性分子的檢測(cè)受到廣泛關(guān)注且被大量研究，但是仍然存在檢測(cè)限高，靈敏度低，選擇性差的缺

2、點(diǎn)，這將極大地限制我們準(zhǔn)確探究活性分子在細(xì)胞生理病理活動(dòng)中所起的作用，無法對(duì)其功能做出準(zhǔn)確判斷。因此發(fā)展高靈敏度和高選擇性的分析方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)它們的檢測(cè)具有重要意義。
　　DNA納米技術(shù)是近幾十年發(fā)展起來的一種以脫氧核糖核酸為結(jié)構(gòu)單元，建造納米尺寸結(jié)構(gòu)的一門技術(shù)。DNA除了作為基因的載體，本身還是一種一維的納米線，能通過組裝構(gòu)建二維平面、三維管狀和多面體等多種結(jié)構(gòu)，在這些三維結(jié)構(gòu)中，DNA四面體結(jié)構(gòu)由于合成簡(jiǎn)單，易于修飾等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在

3、生物傳感和治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。DNA四面體由六條邊和四個(gè)頂點(diǎn)組成，每條邊和每個(gè)頂點(diǎn)都能進(jìn)行功能化修飾染料或其他核苷酸，而且四面體的結(jié)構(gòu)具有易于進(jìn)細(xì)胞，良好的生物相容性，高的核酸酶穩(wěn)定性等特點(diǎn)，使其在生物研究中得到了廣泛的應(yīng)用。
　　氧化石墨烯（GO）納米片是二維單層具有 sp2碳層結(jié)構(gòu)的材料，具有良好的水溶性、兩親性和生物相容性，能將某些含芳香基團(tuán)的疏水分子通過π?π堆積和氫鍵相互作用吸附到其表面。氧化石墨烯的表面能功能修飾

4、羥基、羧基、氨基等活性官能團(tuán)，為進(jìn)一步修飾其他功能性物質(zhì)提供可能。GO具有寬的吸收帶，因此能作為良好的熒光猝滅劑，使得吸附在其表面的染料分子的熒光被猝滅，而且其尺寸在納米級(jí)別，能作為良好的載體將攜帶的物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。
　　本論文分別以DNA四面體和GO作為載體，設(shè)計(jì)合成了兩種納米熒光探針，用于細(xì)胞和活體內(nèi)活性小分子和microRNA(miRNA)的高靈敏檢測(cè)。本論文主要從以下兩方面的工作開展：
　　1、基于 DNA四面體控

5、制染料距離避免自猝滅，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和活體內(nèi)多組分的高靈敏檢測(cè)。目前發(fā)展的多組分的檢測(cè)方法會(huì)引起染料探針的熒光自猝滅從而降低檢測(cè)的靈敏度。為了解決這個(gè)問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于DNA四面體控制染料距離的納米探針，實(shí)現(xiàn)了在同一激發(fā)下對(duì)pH和超氧（O2??）的高靈敏檢測(cè)。DNA四面體是由四條等長(zhǎng)的單鏈經(jīng)過淬火過程組裝形成的，在DNA四面體的一個(gè)頂點(diǎn)處修飾熒光素，在其他三個(gè)頂點(diǎn)處修飾二氫乙錠。熒光素和二氫乙錠分別作為pH和O2??的響應(yīng)基團(tuán)，它們具有

6、相同的激發(fā)波長(zhǎng)（488 nm）和不同的發(fā)射波長(zhǎng)（515 nm和580 nm）。由于兩個(gè)染料分別修飾在四面體的頂點(diǎn)處，它們之間的距離得到了有效的控制，對(duì)比基于介孔硅裝載染料檢測(cè)的方法，該方法降低了熒光自猝滅的效率。實(shí)驗(yàn)證明DNA四面體有良好的生物相容性，能攜帶染料進(jìn)入細(xì)胞和強(qiáng)的抗核酸酶的降解的能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH和O2??的高靈敏檢測(cè)。將該探針應(yīng)用于活體炎癥模型時(shí)，觀察到炎癥區(qū)域pH的下調(diào)和O2??的上調(diào)過程。該方法可通過控制染料距離有

7、效降低自猝滅效率，提高靈敏度，為多組分的檢測(cè)提供了新的可能。
　　2、基于石墨烯（GO）和分子信標(biāo)（MB）的納米探針用于細(xì)胞和活體內(nèi)miRNA的高靈敏檢測(cè)與成像。在 MB的兩端分別修飾兩個(gè)染料分子，由于它們之間距離近而發(fā)生熒光自猝滅，當(dāng) MB吸附到 GO上，染料分子的熒光被進(jìn)一步猝滅，相比于 MB上連接一個(gè)染料的對(duì)比組，納米探針有效的降低了熒光背景；當(dāng)遇到靶分子miRNA時(shí)，納米探針能實(shí)現(xiàn)兩分子的熒光恢復(fù)，而對(duì)比組只能實(shí)現(xiàn)一分子的