研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生和功能恢復(fù)的治療策略.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的創(chuàng)傷性脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）和腦卒中以后，損傷的軸突很難再生。外部環(huán)境和神經(jīng)元的內(nèi)在特性都是CNS軸突再生失敗的原因，內(nèi)因是成熟的神經(jīng)元已經(jīng)失去了再生潛能，外因?yàn)閾p傷后局部微環(huán)境不利于軸突的生長(zhǎng)，外源性的抑制軸突的因子有髓鞘相關(guān)抑制分子，膠質(zhì)瘢痕，炎癥等。決定軸突再生的內(nèi)源性因子有隨年齡變化的基因，轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子，線粒體

2、等。通過中和外源性的抑制分子如NOGO，髓鞘相關(guān)抑制蛋白（Myelin-associated Glycoprotein，MAG），軟骨素酶ABC(Chondroitinase ABC)，免疫調(diào)節(jié)等改善軸突生長(zhǎng)的外部壞境；用基因相關(guān)的技術(shù)調(diào)節(jié)如雷帕霉素靶蛋白(The Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal Transducer and Activator of Tra

3、nscription3，STAT3），Kruppel樣因子（Kruppel-like Factors，KLFs），b-Raf激酶（Raf Kinase，b-Raf）和SOX11等信號(hào)通路，聯(lián)合腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)，睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF），胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like Growth F

4、actor1,IGF1），能很好的促進(jìn)CNS軸突再生，但能應(yīng)用于臨床的治療方法極少。
　　骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）最初在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)可溶性的蛋白，后來研究發(fā)現(xiàn)它可以作為一個(gè)細(xì)胞因子廣泛存在于各個(gè)器官，能夠和細(xì)胞表面的整合素（Integrins）以及CD44結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，激活激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞的粘附，運(yùn)動(dòng)和生存。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用OPN/IGF1/CNTF，能夠促進(jìn)視神經(jīng)損

5、傷后的軸突再生[5,6]；腹腔注射增加軸突傳導(dǎo)速率的鉀離子通道阻斷劑4-氨基吡啶（4-Aiminopyridine,4-AP）和它的衍生物4-氨基吡啶-3-甲醇（4-Aiminopyridine-3-Methanol，4-AP-3-MeOH），能夠促使損傷動(dòng)物的視覺敏感度明顯提高[5]。但是在SCI和腦卒中模型中，OPN/IGF1是否能夠促進(jìn)軸突再生，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)還未可知。
　　程序性死亡1（Programed Dea

6、th-1，PD-1)是一個(gè)I型跨膜蛋白，由一個(gè)IgV樣的胞外段，一個(gè)跨膜區(qū)域和胞內(nèi)段組成。PD-1的胞內(nèi)段分兩部分，免疫受體酪氨酸相關(guān)的抑制性基序（Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif，ITSM）和免疫受體酪氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)化基序（Immunoreceptor Tyrosine-based Switch Motif，ITSM）。PD-1屬于CD28家族成員之一。它的受體（PD-L1/P

7、D-L2）廣泛表達(dá)在T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷性T細(xì)胞（Natural Killer T cell，NKT），巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DC）等。在T細(xì)胞中，PD-1通過和它的受體相互作用，能夠抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌。在B細(xì)胞中，PD-1能夠抑制B細(xì)胞的激活，擴(kuò)增和抗體合成。用PD-1敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，PD-1是免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，在中樞和外周耐受中都發(fā)揮重要作用。腦卒中以后小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞表達(dá)PD

8、-1，和野生小鼠相比，PD-1敲除的小鼠梗死體積變大。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，SCI后，和野生小鼠相比，PD-1敲除的小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)差，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)都顯示PD-1敲除以后促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。
　　在本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物模型中，我們建立兩種模型，錐體束半切模型(Pyramidotomy,PY)和光化學(xué)栓塞腦卒中模型，在損傷的對(duì)側(cè)皮層注射AAV-mcherry和AAV-OPN/IGF1或者AAV-PLAP，每隔一周進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)、錄像，

9、行為學(xué)檢測(cè)方法有糖丸取回（Single-pallet Retrieval），膠帶移除（Sticker Remove），吃意面（Pasta Handling），不規(guī)律水平步行梯（Irregular Ladder Walking）等。損傷后13周腹腔注射4-AP-3-MeOH，檢測(cè)相關(guān)行為學(xué)變化。接著消除OPN/IGF1小鼠部分發(fā)芽的神經(jīng)元后，繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)的行為學(xué)檢測(cè)。最后在損傷20周動(dòng)物灌注取材，進(jìn)行免疫組化染色，分析未損傷軸突向?qū)?cè)發(fā)芽

10、的情況。體外實(shí)驗(yàn)，通過培養(yǎng)小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞，給予脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）刺激后，流式檢測(cè)PD-1及其受體PD-L1/PD-L2的表達(dá)情況。接著分別培養(yǎng)野生小鼠，PD-1敲除小鼠，PD-1高表達(dá)小鼠和PD-L1敲除小鼠來源的巨噬細(xì)胞，給予LPS和IFN-γ刺激不同時(shí)間，用Western Blot，分子克隆，藥物阻斷等方法，研究分析PD-1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子

11、機(jī)制。
　　在PY模型中，行為學(xué)恢復(fù)方面，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組沒有明顯區(qū)別；但皮層注射AAV-OPN/IGF1的頸段脊髓軸突代償性的發(fā)芽明顯多于AAV-PLAP組。直徑4mm的光化學(xué)栓塞模型中，Sticker remove表現(xiàn)為自發(fā)性恢復(fù)；Single-pallet retrieval幾乎沒有恢復(fù)；在損傷后的第十周，實(shí)驗(yàn)組Irregular ladder walking恢復(fù)好于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脊髓未損傷側(cè)軸突向?qū)?cè)發(fā)芽情況與PY類

12、似。接著我們做了直徑為2.5mm的光化學(xué)栓塞模型，同樣在損傷對(duì)側(cè)皮層注射AAV-OPN/IGF1或者AAV-PLAP，進(jìn)行行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在損傷后第八周實(shí)驗(yàn)組Food retrieval和Irregular ladder walking的恢復(fù)情況明顯好于對(duì)照組。小鼠腹腔注射4-AP-3-MeOH以后，AAV-PLAP組行為學(xué)無變化，而AAV-OPN/IGF1的小鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)有了更好的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在損傷的體積方面沒有差異，但是在皮

13、層，皮層下的各個(gè)層面及脊髓頸段和腰段，AAV-OPN/IGF1組的軸突發(fā)芽數(shù)量和標(biāo)記軸突的熒光強(qiáng)度都多于AAV-PLAP組。消除OPN/IGF1組小鼠發(fā)芽至損傷側(cè)的神經(jīng)元后，OPN/IGF1引起的Single-pallet retrieval和Irregular ladder walking的行為學(xué)恢復(fù)也消失；解剖學(xué)分析頸段和腰段發(fā)芽的軸突數(shù)量也相應(yīng)的減少。
　　體外培養(yǎng)腹腔來源的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞系Raw264.7，骨髓干細(xì)胞誘

14、導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和新生鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在LPS+IFN-γ的作用下，小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)PD-1及其受體PD-L1，但不表達(dá)PD-L2；在LPS+IFN-γ作用不同時(shí)間后，和野生型巨噬細(xì)胞相比，PD-1和PD-L1敲除的巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)表達(dá)增高，流式檢測(cè)腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)陽性的細(xì)胞

15、比例也增高，高表達(dá)PD-1的巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS降低；敲除PD-1和敲除PD-L1的巨噬細(xì)胞，Stat1，p-Stat1和p-NF-κB表達(dá)升高，蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB/Akt）/mTOR信號(hào)通路激活增加，高表達(dá)PD-1以后，Stat1和NF-κB蛋白表達(dá)并沒有低于野生型，但mTOR下核糖體蛋白S6激酶（Ribosomal Protein S6 Kinase,S6K）活性明顯降低。野生型和PD-1敲除的腹腔

16、巨噬細(xì)胞，在給予LPS+IFN-γ的同時(shí)用不同濃度的雷帕霉素阻斷mTOR，發(fā)現(xiàn)敲除PD-1的巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)明顯低于WT巨噬細(xì)胞，說明PD-1敲除可能通過Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)，說明應(yīng)用OPN/IGF1能夠促進(jìn)CNS損傷后皮質(zhì)脊髓束（The Corticospinal Tract，CST）的發(fā)芽，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；敲除PD-1以后，可能通過激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)