胎膜早破及妊娠期糖尿病的新策略研究.pdf

1、第一部分基于UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)的胎膜早破血清代謝組學(xué)研究
　　背景：
　　胎膜早破是指在臨產(chǎn)前胎膜自然破裂。胎膜早破是圍生期最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致早產(chǎn)，胎盤(pán)早剝，臍帶脫垂等造成圍生兒病死率增加，宮內(nèi)感染率及產(chǎn)褥感染率升高。導(dǎo)致胎膜早破的原因有很多，也有可能是多因素相互作用而導(dǎo)致的結(jié)果。目前，胎膜早破的發(fā)病機(jī)制還不明了。代謝組學(xué)（metabolomics）是繼基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)后發(fā)展起來(lái)的新興組學(xué)，通過(guò)分析內(nèi)

2、源性代謝物的變化從而反映機(jī)體的狀態(tài)。將代謝組學(xué)的研究應(yīng)用于母胎醫(yī)學(xué)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的預(yù)測(cè)、診斷及發(fā)病機(jī)制的闡釋，對(duì)母體和胎兒預(yù)后有重要意義。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)利用高靈敏、高準(zhǔn)確性、高分離度，快速、自動(dòng)化的UPLC/Q-TOF-MS代謝組學(xué)的研究平臺(tái)，對(duì)PROM孕婦和健康對(duì)照孕婦的血清標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，分析胎膜早破與健康對(duì)照孕婦在代謝物水平上是否存在差異，從中找到可能的疾病標(biāo)志物。同時(shí)從代謝水平層面探索PROM的發(fā)病

3、機(jī)制。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用UPLC/Q-TOF-MS的研究平臺(tái)，探討PROM孕婦(n=22)和健康對(duì)照組（n=31）之間的血清代謝組的變化。通過(guò)MarkerView v1.2.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和歸一化處理，運(yùn)用SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），采用PCA模型區(qū)別樣本總體性的差異，從整體上初步了解組間的分組情況。利用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）建立統(tǒng)計(jì)模型，進(jìn)一步分析樣本間的

4、差異。根據(jù)OPLS-DA模型變量重要投影（VIP），篩選出VIP大于1的變量，同時(shí)結(jié)合SPSS非參數(shù)檢驗(yàn)篩選出差異代謝物。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)PCA和OPLS-DA分析后PROM與健康對(duì)照孕婦能夠明顯區(qū)分開(kāi)，最終找到了18中差異代謝物。PROM孕婦與健康對(duì)照孕婦相比主要在以下種類中發(fā)生變化：甘油磷脂類如PE（磷脂酰乙醇胺），PC（磷脂酰膽堿）；脂肪酰類如L-Carnitine（左旋肉堿），Resolvin D5（消退素5），

5、L-Acetylcarnitine（乙酰肉堿）；脂肪酸類如Calendic acid（十八碳三烯酸），Lucidenic acid C（赤芝酸C）；氨基酸類如5-Aminopentanoic acid（氨基戊酸）， N-(3-Methylbutyl)acetamide（ N-3甲基乙酰），5-Hydroxyindoleacetaldehyde（5-羥乙醛）。
　　結(jié)論：
　　這些差異代謝物可能通過(guò)脂肪酸氧化、脂肪酸代謝、氨基

6、酸代謝和甘油磷脂代謝紊亂，導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。通過(guò)對(duì)胎膜早破的代謝組學(xué)分析有利于疾病的早期診斷與干預(yù)管理，是未來(lái)臨床發(fā)展的新領(lǐng)域。
　　第二部分基于酶和分子信標(biāo)介導(dǎo)的鏈置換放大反應(yīng)檢測(cè)妊娠期糖尿病相關(guān)microRNA的研究
　　背景：
　　妊娠期糖尿病是指在妊娠前沒(méi)有任何程度的血糖異常，在妊娠期才患有的糖尿病，是妊娠最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。血清miRNA（microRNA）異常表達(dá)與相關(guān)疾病的早期診斷、預(yù)后判斷密切相關(guān)。越

7、來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA是涉及糖尿病的發(fā)病機(jī)制。血清miRNA222可作為非侵入性生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)GDM的發(fā)展。
　　目的：
　　對(duì)于miRNA分析的傳統(tǒng)方法有Northern雜交，微陣列分析和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）。但是這些方法需要消耗大量的樣品、對(duì)儀器要求高且昂貴、比較耗時(shí)費(fèi)力等。發(fā)展靈敏、快速、簡(jiǎn)便的miRNA檢測(cè)新方法具有重大意義。本研究通過(guò)酶和分子信標(biāo)介導(dǎo)的鏈置換放大反應(yīng)建立了一個(gè)高度敏感和高特異性的電

8、化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)miRNA。
　　方法：
　　本研究基于酶和分子信標(biāo)介導(dǎo)的鏈置換放大反應(yīng)檢測(cè)妊娠期糖尿病相關(guān)miRNA。當(dāng)靶miRNA存在時(shí)，miRNA與相應(yīng)部分的特異性雜交使莖環(huán)被打開(kāi)，觸發(fā)鏈置換（SDA）擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分可以與固定在電極上的捕獲探針進(jìn)行雜交，另一部分與生物素化的檢測(cè)探針雜交,通過(guò)生物素親和素系統(tǒng)的橋接作用可以連接到堿性磷酸酶并產(chǎn)生酶的電化學(xué)信號(hào)用于miRNA的定量檢測(cè)。
　　結(jié)果：<