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文檔簡介
1、第一部分D-半乳糖誘導的SD大鼠擬老化模型的建立
目的:建立 D-半乳糖誘導的擬老化SD大鼠模型。
方法:90只4周齡的SD大鼠,隨機分為兩組, D-半乳糖組(擬老化組):于頸背部皮下,注射500mg/kg/d D-半乳糖,連續(xù)8周;對照組:等體積0.9%的生理鹽水,頸背部皮下注射,連續(xù)8周。造模結(jié)束后,D-半乳糖組和對照組按時間點各分為三個亞組:3月齡組(給藥結(jié)束后0個月),9月齡組(給藥結(jié)束后6個月)和15月齡組
2、(給藥結(jié)束后12個月)。給藥結(jié)束后,檢測大鼠聽性腦干反應(yīng)(Auditory Brainstem Response, ABR);酶標儀檢測總超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde termimal,MDA)的水平;實時定量PCR檢測聽皮層線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常見缺失突變(Common Deletion, CD)的
3、水平;甲苯胺藍染色法觀察聽皮層神經(jīng)元細胞密度的變化;透射電鏡觀察聽皮層神經(jīng)元細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
結(jié)果:ABR聽力檢測顯示:在相同頻率(4KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz),同齡D-半乳糖組和對照組相比,聽力閾值未見顯著性統(tǒng)計學差異(p>0.05)。對照組中,在8kHz、16kHz、24kHz、32kHz頻率,15月齡較9月齡,3月齡大鼠聽力閾值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。D-半乳糖組中,在4
4、KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz頻率,15月齡較9月齡、3月齡大鼠聽力閾值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與同齡對照組相比,9月齡、15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與同齡對照組相比,3月齡,9月齡,15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。D-半乳糖組mt DNA CD與同齡對照組相比升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
5、在對照組中,15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD缺失率升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。甲苯胺藍染色法顯示,15月齡D-半乳糖組較其他各年齡組神經(jīng)元密度下降,差異具有統(tǒng)計學意義,(P<0.05)。透射電鏡觀察到D-半乳糖組大鼠比對照組大鼠出現(xiàn)衰老樣超微結(jié)構(gòu)病理變化如細胞核變形、染色質(zhì)異常分布、線粒體腫脹、脂褐素聚集、神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變等的時間更早,而且這些變化更顯著。
結(jié)論:
6、隨年齡增長,聽皮層抗氧化酶的活性下降,mtDNA CD蓄積增加,神經(jīng)元密度降低,神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)退行性變,而且D-半乳糖組較對照組這些變化出現(xiàn)的更早,更明顯。長時程、高劑量的D-半乳糖會加速聽皮層細胞的衰老。
第二部分 Sestrin2蛋白以及自噬在D-半乳糖誘導的擬老化大鼠聽皮層中的作用及作用機制
目的:老年性聾是老年人最常見的感覺障礙疾病,它會導致老年人身體、認知、情緒、行為等一系列的功能障礙。目前老年性聾
7、的發(fā)病機制還不清楚。本研究目的是探討自噬,以及自噬相關(guān)調(diào)控通路蛋白Sestrin2,AMPK以及p70S6K蛋白在D-半乳糖擬老化大鼠聽皮層中的作用。
方法:將120只4周齡的SD大鼠,隨機分為兩組給藥:D-半乳糖組(擬老化組):D-半乳糖500mg/kg/d,頸背部皮下注射,連續(xù)8周;對照組:等體積0.9%生理鹽水,頸背部皮下注射,連續(xù)8周。給藥結(jié)束后,D-半乳糖組和對照組按時間點各分為三個亞組:3月齡組(給藥結(jié)束后0個月)
8、,9月齡組(給藥結(jié)束后6個月)和15月齡組(給藥結(jié)束后12個月)。酶標儀檢測總超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)和丙二醛(Malondialdehyde termimal,MDA)的水平;實時定量PCR檢測聽皮層線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常見缺失突變(Common Deletion, CD)的水平。實時定量PCR法檢測beclin1/Atg6, LC3
9、B/Atg8, Sestrin2 mRNA的表達水平。Westrrn blotting法檢測LC3B, Beclin1, Sestrin2, p-p70S6K, p70S6K, p-AMPK, AMPK的蛋白水平。免疫熒光檢測LC3B在聽皮層的定位表達。
結(jié)果:9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平較同齡對照組降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3月齡,9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平比同齡對照組增
10、高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 D-半乳糖大鼠聽皮層mt DNA CD與同齡對照組相比升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組組內(nèi)比較,15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,與同齡對照組相比,9月齡D-半乳糖組大鼠聽皮層Atg6mRNA表達水平上升1.09倍, P<0.05;與同齡對照組相比,3月齡以及9月齡D-半
11、乳糖組大鼠聽皮層Atg8mRNA表達水平分別上升0.2和0.27倍, P<0.05;Sestrin2 mRNA表達水平分別上升0.33和0.52倍, P<0.05。15月齡時,與對照組相比,D-半乳糖組Atg6mRNA、Atg8mRNA、Sestrin2 mRNA表達水平分別下降0.76倍,0.33倍和0.83倍, P<0.05。對照組組內(nèi)比較時,9月齡以及15月齡大鼠較3月齡大鼠聽皮層Atg8mRNA表達水平分別上升0.29和0.21
12、倍, P<0.05;Sestrin2 mRNA表達水平分別上升0.62和0.83倍, P<0.05。Western blotting結(jié)果顯示:與同齡對照組相比,3月齡以及9月齡D-半乳糖組聽皮層Beclin1蛋白水平分別升高0.34,0.52倍, P<0.05;LC3Ⅱ/β-actin比率分別升高0.71和1.21倍, P<0.05;Sestrin2蛋白水平分別升高1.03和0.27倍, P<0.05;p-AMPK/AMPK比率升高1.
13、57和0.67倍, P<0.05, p-p70S6K/p70S6K比率下降1.86和1.21倍, P<0.05。15月齡時,與對照組相比,D-半乳糖組大鼠Beclin1蛋白水平下降0.31倍,LC3Ⅱ/β-actin下降0.80倍,Sestrin2蛋白水平下降0.37倍,p-AMPK/AMPK比率下降1.11倍, p-p70S6K/p70S6K比率升高1.89倍, P<0.05。在對照組中,9月齡、15月齡較3月齡大鼠LC3Ⅱ/β-ac
14、tin比率升高0.61和0.37倍, P<0.05;Sestrin2蛋白水平升高0.58和0.58倍, P<0.05;p-AMPK/AMPK比率升高0.71和1.04倍, P<0.05;p-p70S6K/p70S6K比率下降1.63和1.62倍, P<0.05。
結(jié)論:在D-半乳糖誘導的擬老化SD大鼠年齡增長的過程中,自噬水平也在改變,Setrin2-AMPK-p70S6K可能參與年齡相關(guān)的自噬活動的調(diào)節(jié)。大鼠年輕時,即3月齡
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