輻射誘導型SOD2過表達慢病毒載體的構(gòu)建及其在結(jié)腸癌放療中的輻射防護和放療增敏效應.pdf

1、背景：
　　放療是腫瘤綜合性治療中不可或缺的核心技術之一，在對腫瘤的局部控制中，輻照不可避免的會對腫瘤周圍的正常組織造成損傷。為降低輻照對正常組織的損傷，輻照的劑量和時間會受到嚴格限制，在一定程度上也制約了放療的治療效果。多葉準直器、精確的固定技術、輻射防護劑等常用來減輕放射性損傷，但是效果并不理想，并且輻射防護劑缺乏靶向性，同時也會對腫瘤組織起到保護作用，從而降低了放療的效果。放療增敏劑也存在類似的問題，在對腫瘤起到放療增敏效應

2、的同時，往往也會增強照射野內(nèi)正常組織的敏感性，導致放射損傷加重。
　　基因治療是目前腫瘤治療的熱點，通過激活抑癌基因、引入細胞毒性基因、阻斷癌基因、提高腫瘤免疫原性、改變腫瘤微環(huán)境等策略起到有效的抑瘤作用。SOD2是定位于細胞線粒體內(nèi)的超氧化物歧化酶，可以清除細胞內(nèi)的氧自由基，是細胞對抗氧化損傷的重要機制，也被視為效果確切的輻射防護劑。另有多項研究表明，SOD2具有抑癌基因的作用，能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并且能提高腫瘤細胞對放射治

3、療的敏感性。然而，由于目前缺乏靶向輻射野的有效基因轉(zhuǎn)染方法以及對導入的基因表達進行調(diào)控，從而限制了SOD2基因治療在臨床的推廣應用。
　　Egr-1基因的啟動子區(qū)域含有6個CArG盒，該區(qū)域為輻照誘導調(diào)控序列，可直接感受輻照刺激。構(gòu)建含有CArG盒的嵌合啟動子，可以優(yōu)化啟動子的啟動效率，降低本底表達。通過構(gòu)建下游連接SOD2基因的輻射誘導型嵌合啟動子，有望通過控制輻照劑量和時間對SOD2基因的表達進行精確調(diào)控，賦予SOD2基因治療

4、時空限制性表達的特點。
　　目的：
　　為解決目前放療增敏中“增敏腫瘤和正常損傷加重并存”的臨床難題，本課題嘗試構(gòu)建輻照誘導型嵌合啟動子驅(qū)動的 SOD2慢病毒過表達載體，通過控制輻照的劑量和時間，不僅可以實現(xiàn)靶向性、可調(diào)控性基因治療，還同時實現(xiàn)對腫瘤的放療增敏作用和對正常組織的輻射保護作用。這樣在腫瘤放療時兼有保護正常組織和抑制腫瘤細胞的作用，不僅可以提高腫瘤的放射治療的效果，還能減低放療對正常組織的損傷，提高腫瘤患者的生存

5、質(zhì)量；鑒于此，靶向SOD2的基因治療有望在今后的腫瘤放射治療中有較好的應用前景。
　　方法：
　　1.含有報告基因和治療基因的慢病毒制備：
　　全基因合成含有CArG盒-CMV基礎啟動子的嵌合啟動子片段，以慢病毒載體pLVX-AcGFP1-N1為骨架，分3步克隆策略構(gòu)建輻照誘導型啟動子驅(qū)動的治療基因慢病毒載體 pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP1和報告基因慢病毒載體pLVX-C9BC-AcGFP1-N1。

6、經(jīng)酶切、測序驗證構(gòu)建成功后，擴增轉(zhuǎn)化的stbl3菌株，去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒，以293FT細胞株為工具細胞，三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)進行慢病毒包裝，測定病毒滴度。
　　2.嵌合啟動子的輻射誘導特性和量化調(diào)控特征：
　　報告基因慢病毒和治療基因慢病毒分別感染HT-29細胞株和CCD841 CoN細胞株，藥物篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。以不同的照射劑量處理穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株后，不同時間點觀察HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株報告基因和治療基

7、因的表達，以明確輻照誘導型啟動子的啟動活性和特點。
　　3.穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株輻射處理后SOD2表達及表型變化：
　　HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株輻照處理后，檢測下游治療基因SOD2的表達；觀察不同處理組的細胞增殖、生長、凋亡的變化。
　　4.輻射啟動SOD2基因治療裸鼠移植瘤的體內(nèi)實驗研究：
　　首先用 HT-29細胞株建立BALB/c裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型構(gòu)建成功后，局部注射治療基因慢病毒并在72h后

8、給予輻照處理，觀察治療基因表達情況以及腫瘤生長曲線、組織病理學變化和原位凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建報告基因慢病毒pLVX-C9BC-AcGFP1-N1和治療基因慢病毒 pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP1，經(jīng)測序驗證序列正確。病毒包裝后測定滴度在5×108TU/ml以上，滿足實驗要求。嘌呤霉素藥物篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，擴增培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩?br>　　2. HT-29和CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株實驗表

9、明，輻照誘導型嵌合啟動子能在2Gy照射下有效啟動下游基因的表達，照射處理后24h報告基因AcGFP1和治療基因SOD2表達量開始增加，至48h接近平臺期。
　　3.體外實驗發(fā)現(xiàn)，含治療基因的HT-29穩(wěn)轉(zhuǎn)株在6Gy輻照處理后，SOD2表達明顯增高，細胞的增殖和生長較之于對照組明顯受到抑制，凋亡比率增加。含治療基因的CCD841 CoN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株在輻照處理后，SOD2表達明顯增高，較之于對照組細胞增殖和生長受到較小抑制，凋亡比率相對

10、較低。
　　4.體內(nèi)實驗，成功建立HT-29 BALB/c裸鼠移植瘤模型，分組后給予慢病毒注射，72h進行6Gy局部照射處理。觀察發(fā)現(xiàn)，較之于對照組荷瘤裸鼠，注射治療基因慢病毒的裸鼠局部輻照后，腫瘤細胞內(nèi)SOD2表達水平顯著增高，腫瘤生長遲緩，凋亡細胞增多；注射治療基因的皮膚組織凋亡細胞減少。
　　結(jié)論：
　　由串聯(lián)的CArG盒和CMV基礎啟動子構(gòu)成的嵌合型啟動子具有明顯的輻射誘導特性，在輻射處理下能有效啟動下游基因的