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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
第一部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
目的:針對課題組在國內(nèi)首次制備具有溫敏特性的殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖(HBC)水凝膠,通過該材料在體外對成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長影響的研究,探討該材料的細(xì)胞學(xué)行為,為材料的最終臨床應(yīng)用提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:1.HBC浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的影響于37℃下將HBC水凝膠浸提于DMEM培養(yǎng)液24小時得浸
2、提液。設(shè)置陰性對照組、苯酚陽性對照組及25%、50%、75%、100%濃度浸提液四個實(shí)驗(yàn)組,設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板,10孔平行對照組,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察L929細(xì)胞生長情況,通過MTS法測定吸光度OD值,計(jì)算出不同組細(xì)胞的存活率。將L929細(xì)胞分別用陰性對照液、50%HBC浸提液及100%HBC浸提液進(jìn)行培養(yǎng),3天后用流式細(xì)胞學(xué)的方法檢測L929細(xì)胞凋亡情況。
2.HBC浸提液對
3、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人肺成纖維細(xì)胞(HLF)的影響設(shè)25%、50%、75%、100%HBC浸提液4個實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組,將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人肺成纖維細(xì)胞(HLF)在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每個實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入100μl待測液,設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板,10孔平行對照組,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞的生長情況,通過MTS法測定HUVEC細(xì)胞的吸光度OD值,計(jì)算出不同濃
4、度組HUVEC細(xì)胞的存活率。
結(jié)果:在HBC浸提液L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,25%、50%和75%、100%濃度的浸提培養(yǎng)液組及陰性對照組細(xì)胞死亡情況較苯酚陽性對照組有顯著差異(P<0.001),HBC浸提液可明顯抑制L929細(xì)胞的生長,促進(jìn)其凋亡。流式細(xì)胞學(xué)檢測:HBC浸提液可以將L929細(xì)胞部分阻礙在G1期向S期分化過程中(P<0.05),驗(yàn)證了其凋亡存在性。HBC浸提液對HUVEC無細(xì)胞毒性,且100%浸提液對于HUVEC
5、細(xì)胞較陰性對照組有輕度促進(jìn)生長作用(P<0.001)。通過觀察發(fā)現(xiàn)第4天HLF細(xì)胞也出現(xiàn)了與L929細(xì)胞相似的凋亡細(xì)胞學(xué)形態(tài)。
結(jié)論:溫敏性羥丁基殼聚糖(HBC)未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性,可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長,但對成纖維細(xì)胞有一定的抑制作用。
第二部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究動物實(shí)驗(yàn)
目的:本研究使用羥丁基殼聚糖(HBC),研制出一種新型可原位注射、溫敏性凝膠系統(tǒng)。通過動物體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)、致熱原
6、實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、免疫毒性實(shí)驗(yàn)等,初步評價該材料的生物安全性,為材料的最終臨床應(yīng)用提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:1.急性毒性實(shí)驗(yàn)將HBC水凝膠在生理鹽水下浸提24小時后,濾去沉淀,得到HBC生理鹽水浸提液。將清潔級健康SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組,每組各5只,通過尾緣靜脈以0.1mL/s的速度、50mL/kg的劑量注射入實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi),觀察大鼠死亡情況。
2.致熱原實(shí)驗(yàn)通過耳緣靜脈將上述HBC生理鹽水浸提液以0.1m
7、L/s的速度、2.5mL/kg的劑量注射入7只清潔級新西蘭兔體內(nèi)后,觀察體溫變化情況。
3.皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)將4種不同的待測液(100%HBC浸提液、50% HBC浸提液、生理鹽水、苯酚溶液)通過皮內(nèi)注射入5只清潔級新西蘭兔的背部,觀察其皮膚改變情況。
4.免疫毒性實(shí)驗(yàn)將80只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組和對照組,腹腔給藥2周,每周2次,恢復(fù)周期14天,檢測大鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)后進(jìn)行比較。取大鼠股骨骨髓組織,用吉姆薩染液染
8、色后觀察骨髓涂片。
結(jié)果:HBC浸提液注入SD大鼠體內(nèi)一周后未引起大鼠死亡及不適,急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔體內(nèi)未引起實(shí)驗(yàn)動物體溫升高,致熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔背部皮膚,實(shí)驗(yàn)組皮膚刺激反應(yīng)與陰性生理鹽水組相似,無明顯皮膚顏色改變,而與陽性對照組有顯著性差異。血清免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgA、IgG、補(bǔ)體C3、殺傷型(CD3+CD8+)T細(xì)胞等檢測指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值<0
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