消毒方法對殼聚糖溫敏凝膠生物相容性及牙周組織再生影響的研究.pdf

1、背景：
　　牙周病是一種慢性感染性疾病，它主要造成牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)、牙齦的破壞，是造成人類牙齒缺失的主要原因之一。牙周治療的目標(biāo)就是控制炎癥，并且使已經(jīng)破壞的牙周組織得以再生而形成新的附著。牙周基礎(chǔ)治療能有效的控制牙周炎癥，但對于牙周支持組織喪失較多的重度牙周炎，尚不能達(dá)到牙周組織再生的目的。隨著牙周組織工程技術(shù)的發(fā)展，為牙周病的治療帶來了新的希望。其中牙周支架或載體材料的已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。
　　殼聚糖溫敏凝膠

2、具有其他支架材料所沒有的體溫固化特性，在室溫或低于室溫時(shí)呈流動(dòng)性好的溶膠狀態(tài)，當(dāng)溫度提高接近人體體溫（37℃）時(shí)，便可在短時(shí)間內(nèi)凝膠化，呈不可流動(dòng)的膠凍狀。由于其具有良好的組織相容性、無毒性、抗菌性、黏附性、促進(jìn)組織再生性、可修飾性等諸多優(yōu)點(diǎn)，有望作為促進(jìn)牙周組織再生的支架材料得到更廣泛的應(yīng)用。然而，有報(bào)道目前常規(guī)的消毒方法會(huì)造成殼聚糖溫敏凝膠的粘度、力學(xué)性能的降低，分子量的損失，這將限制其應(yīng)用效能，對此，我們設(shè)計(jì)了本研究。
　　

3、目的：
　　改進(jìn)殼聚糖的消毒方法，檢測其物理性能及生物相容性，并與常規(guī)消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠做比較研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測其促進(jìn)牙周組織再生性能。對其作為牙周組織工程支架材料前景奠定基礎(chǔ)。
　　方法與結(jié)果：
　　1不同消毒方法殼聚糖溫敏凝膠的制備及其物理性能的對比研究
　　1.1制備兩種不同消毒方法的殼聚糖溫敏凝膠
　　制備改進(jìn)消毒方法殼聚糖溫敏凝膠：0.2g殼聚糖粉單獨(dú)高溫高壓消毒（120℃/10min）

4、后，加入9ml鹽酸溶液，磁力攪拌器攪拌2h直至完全溶解制成A液，0.56 gβ-甘油磷酸鈉溶解于1 mL雙蒸水中，0.22μm除菌濾器過濾消毒作為B液，A、B液冰浴15分鐘后，將B液逐滴加入A液攪拌10min，即可獲終濃度為2％的改進(jìn)型殼聚糖溫敏凝膠；
　　制備常規(guī)消毒方法殼聚糖溫敏凝膠：0.2g殼聚糖粉加入于9ml鹽酸溶液，磁力攪拌器攪拌2h直至完全溶解后高溫高壓消毒（120℃/10min）制成A液，同法制備B液和溫敏凝膠。

5、r>　　1.2兩種不同消毒方法殼聚糖溫敏凝膠物理性能檢測
　　將兩組不同消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)，檢測其凝膠化時(shí)間，粘度測試儀（Brookfield HBT）檢測其動(dòng)態(tài)粘度，掃描電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。
　　1.3結(jié)果
　　改進(jìn)消毒方法組殼聚糖溫敏凝膠凝膠化時(shí)間為5-6min，較常規(guī)消毒方法組凝膠化時(shí)間縮短一半，且更加穩(wěn)定；粘度測試結(jié)果顯示，無論從初始粘度到最終粘度，均較常規(guī)消毒方法組殼聚糖溫敏凝

6、膠的粘度提高近10倍；兩組不同消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠均具有三維立體網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，但改進(jìn)消毒方法組殼聚糖溫敏凝膠較常規(guī)消毒方法組的孔徑明顯縮小。
　　2不同消毒方法殼聚糖溫敏凝膠生物相容性的對比研究
　　2.1人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)
　　取18歲以上志愿者因正畸減數(shù)拔除的牙周組織健康、無齲齒的新鮮前磨牙，雙抗PBS溶液反復(fù)沖洗3遍，刮取根中1/3處牙周膜，采用酶消化法原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞，每隔三天換培養(yǎng)液一次，常規(guī)傳代后，

7、取生長良好的第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.2人牙周膜細(xì)胞在兩種溫敏凝膠表面生長情況觀察
　　在兩組不同消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠表面培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，7天后DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察，檢查細(xì)胞數(shù)量，檢測兩組溫敏凝膠的細(xì)胞相容性。
　　2.3不同消毒方法殼聚糖溫敏凝膠浸提液對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響
　　制備浸提液：分別取兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠各5ml，置于50ml無菌試劑瓶中，加入45ml含10％胎

8、牛血清的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，浸泡24小時(shí)后吸取培養(yǎng)液作為浸提液用于實(shí)驗(yàn)。
　　用兩組不同消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠浸提液培養(yǎng)第三代健康人牙周膜細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　2.4結(jié)果
　　人牙周膜細(xì)胞不僅在兩組不同消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠表面均生長良好，且在兩組殼聚糖溫敏凝膠浸提液中也增殖正常。改進(jìn)消毒方法組殼聚糖溫敏凝膠與常規(guī)消毒方法組均具有良好的生物相容性。
　　3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　3.1實(shí)

9、驗(yàn)分組
　　健康雜種犬3只，每只犬上下頜兩側(cè)4個(gè)區(qū)隨機(jī)選第第二、三前磨牙為實(shí)驗(yàn)牙。隨機(jī)分為改進(jìn)消毒方法殼聚糖溫敏凝膠組、空白對照組。
　　3.2動(dòng)物骨缺損制備及手術(shù)
　　制備犬前磨牙Ⅲ度根分叉牙周骨缺損模型，用裂鉆在牙槽骨缺損區(qū)根面上平起于牙槽嵴處磨出切跡，作為組織學(xué)觀察標(biāo)志點(diǎn)。將改進(jìn)消毒方法殼聚糖溫敏凝膠植入骨缺損區(qū)。12周后取材進(jìn)行大體學(xué)及組織學(xué)觀察，檢測牙周組織再生情況。
　　3.3結(jié)果
　　改進(jìn)消毒